林蛙油鑒別的研究進(jìn)展

金 平，張 宇，王 會，蘭 夢，張 輝，孫佳明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

哈蟆油（Oviduetus Ranae）俗稱田雞油、哈螞油、哈士蟆油，系蛙科動物中國林蛙（Rana temporaria chensinesis David）雌蛙的輸卵管經(jīng)干燥而得[1]。哈蟆油始載于《本草綱目》，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺等功能，主要用于身體虛弱、病后失調(diào)、精神不足、癆嗽咳血等癥。哈蟆油作為傳統(tǒng)而名貴的中藥材，因其價格高昂，市場上同屬和混偽品較多，藥材的真?zhèn)舞b別更加的重要[2]。除傳統(tǒng)的四大鑒定方法外，現(xiàn)在還有高效毛細(xì)管電泳、紅外指紋圖譜、HPLC指紋圖譜、分子生物學(xué)等鑒別方法。

1 傳統(tǒng)的鑒別方法

1.1 基源鑒別 中國林蛙外形似青蛙，體長約為7～9 cm。頭部長與寬相等，吻端位置略突出于下頜。眼間距等于上眼瞼寬度小于鼻間距，前肢短而后肢長且長度超過體長的一半，疣粒存在與脛跗關(guān)節(jié)前達(dá)眼，兩側(cè)褶間以及肩部并以 V形排列，膚色在季節(jié)不同時存在不同，秋冬較夏季略深，顏色分別為褐色和黃褐色，腹面為紅黃色，有灰白色斑點(diǎn)塊[3]。

1.2 性狀鑒別 輸卵管為黃白色并帶有脂肪樣光澤，可見毛細(xì)血管，長度為體長的4～8倍，重量為體質(zhì)量的20%～26%，大小不一重疊成塊狀或片狀。有些帶有灰白色薄膜狀干皮和黑色卵塊，質(zhì)地硬而脆。鑒別時以顏色偏白，個大肥厚有光澤，并且不存在黑色卵塊和干皮為優(yōu)[4]。

1.3 顯微鑒別 滕淼娟[5]對哈蟆油及一種偽品癩哈蟆油進(jìn)行顯微鑒定。顯微鏡下通過對腺體細(xì)胞形狀、排列、細(xì)胞壁及腺體紋理的區(qū)別，來鑒別哈蟆油的真?zhèn)巍?/p>

1.4 理化鑒別

1.4.1 膨脹度 滕淼娟[5]運(yùn)用溫水試驗哈蟆油迅速膨脹且體積增大至15倍且為白色棉絮狀，而癩哈蟆油吸水少、膨脹慢不呈棉絮狀，體積增大近7倍。而膨脹度測定按藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不得低于55，真品為58符合規(guī)定，而偽品僅為21.8。

1.4.2 熒光鑒別 張琴等[6]根據(jù)真?zhèn)纹吩?65 nm波長的熒光燈下顯色不同進(jìn)行鑒別，即正品為黃色熒光，偽品為亮藍(lán)色熒光。

1.4.3 薄層色譜鑒別 徐陽[7]較原有的哈蟆油薄層鑒別方法，增加了膽固醇、7-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇和 LD-2作為對照物質(zhì)，在254 nm紫外燈光下，噴以10%硫酸乙醇溶液檢視，此方法具有快速、準(zhǔn)確、成本低廉等優(yōu)勢，可作為哈蟆油鑒別的參考方法。

2 儀器分析的鑒別方法

2.1 凝膠電泳法 富玉海等[8]運(yùn)用凝膠電泳法鑒別正偽品哈士蟆油，正品有明顯6個條帶，偽品由于不純而條帶數(shù)量不明確。鮑悅等[9]分別取舒蘭、樺甸、內(nèi)蒙古、青海4個地區(qū)的哈蟆油作為正品哈蟆油，并將大蟾蜍輸卵管作為偽品，將其進(jìn)行 SDS- PAGE電泳的凝膠成像分析，結(jié)果得出4個不同區(qū)域的哈蟆油均有明顯的6條主帶，而偽品明顯的譜帶只有一條帶。

2.2 HPLC指紋圖譜法 白雪媛等[10]用95%乙醇作為哈蟆油提取溶劑，以乙腈- 0.5%磷酸溶液為流動相進(jìn)行檢測，運(yùn)用色譜聚類分析得出不同品種之間存在顯著差別。黃玉明等[11]對15批正品林蛙油其偽劣品進(jìn)行 HPLC圖譜分析比對，結(jié)論以相似度為0.85作為合格標(biāo)準(zhǔn)。李津明等[12]運(yùn)用HPLC測定10批林蛙油樣品的丙酮提取物，結(jié)果得出17個相應(yīng)位置的共有峰作為鑒定林蛙油的指標(biāo)峰。

2.3 紅外光譜法 王永生等[13]分析不同產(chǎn)地來源的哈蟆油使用不同的紅外光譜儀對同一藥材進(jìn)行了對比試驗。根據(jù)不同產(chǎn)地的正品哈蟆油主成分種類相似在譜圖中的存在相關(guān)系數(shù)建立了正品哈蟆油紅外特征光譜，可作為哈蟆油的質(zhì)量控制的依據(jù)。

2.4 紫外光譜法 王永生等[14]將收集到的7個不同的偽品和5種正品哈蟆油的有機(jī)溶劑超聲提取液分別進(jìn)行了紫外光譜法鑒別對比分析，且真?zhèn)纹吩诜逍巍⑽辗鍞?shù)量和峰位均有明顯差別。

2.5 原子吸收光譜法和發(fā)射光譜法 王秋雨等[15]用原子分光光度計入和等離子發(fā)射光譜儀測定哈蟆油與青蛙油中微量元素和重金屬的含量，結(jié)果顯示兩者均含有人體所必需的常用微量元素，但青蛙油中重金屬含量超出標(biāo)準(zhǔn)范圍。李媛媛等[16]采用等離子體發(fā)射光譜法對國產(chǎn)和俄羅斯產(chǎn)哈蟆油進(jìn)行無機(jī)元素含量分析。

3 分子生物學(xué)

3.1 RAPD法鑒別 張晗思等[17]對哈蟆油及其4種常見混偽品堿裂解法提取基因組 DNA，2步循環(huán)PCR程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，該方法在加入2 μL 100×SYBR Green I染料，正品顯明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。此方法準(zhǔn)確、簡便、快捷。

3.2 COI條形碼DNA分子鑒定 王孟虎等[18]建立了東北、中國、恒仁、黑龍江林蛙的COI基因數(shù)據(jù)庫，能有效區(qū)分不同地域林蛙，說明DNA分子鑒定技術(shù)是鑒定哈蟆油基原動物的新的方法。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，本文從傳統(tǒng)的鑒別、儀器分析鑒別和分子生物學(xué)鑒別3個方面闡述了林蛙油鑒別方法的研究進(jìn)展?？梢钥闯鲋兴幉馁|(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的技術(shù)方法越來越先進(jìn)和完善。不同學(xué)科的相互補(bǔ)充和結(jié)合，加速中藥鑒別的發(fā)展。傳統(tǒng)的方法固然經(jīng)典，但是新的技術(shù)更加的準(zhǔn)確與快速。我們應(yīng)該進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)中藥鑒別特征性甚至是專屬性的物質(zhì)，為中藥的鑒定提供更好的方法。