胰腺癌生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

汪明瓊，楊秀珍綜述，湯麗平審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400016）

胰腺癌為常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，90%的患者是起源于胰腺腺管上皮的胰腺導(dǎo)管腺癌（PDCA），因其早期診斷困難、惡性程度高，發(fā)病率和病死率持續(xù)增加。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2017年美國(guó)有約53 670人被診斷為胰腺癌，并且約有43 090人在2017年因胰腺癌死亡，發(fā)病率與死亡率大致相當(dāng)[1]。另?yè)?jù)我國(guó)2015年惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)分析，2011年胰腺癌在中國(guó)的常見腫瘤中排名第 9 位[2]。

盡管胰腺癌在多模式治療方面取得了新的進(jìn)展，但該病預(yù)后差及高死亡率仍然沒有改變。目前，胰腺癌的治療方法主要以手術(shù)為主，早期胰腺癌的根治性手術(shù)切除后5年生存率僅為30%～60%，其中直徑小于10 mm預(yù)后較好[3]，而晚期胰腺癌5年生存率不足5%。胰腺癌具有較高的侵襲性，出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)多數(shù)已合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)手術(shù)切除機(jī)會(huì)，放、化療效果也不理想。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是有效治療胰腺癌、改善預(yù)后的關(guān)鍵。

1 胰腺癌早期診斷現(xiàn)狀

對(duì)胰腺癌高危人群或前期病變的有效識(shí)別及篩查方法包括重視胰腺癌高危因素及早期癥狀的認(rèn)識(shí)、腫瘤標(biāo)記物（CA19-9、CA24-2等）的聯(lián)合檢測(cè)、分子生物學(xué)檢查及應(yīng)用內(nèi)鏡及影像學(xué)方法等。胰腺是位于后腹膜的器官，這也導(dǎo)致其起病隱匿，前期癥狀包括厭食、體重下降等，且均缺乏特異性[4]，需要與常見的胃腸道、胰膽道疾病鑒別，容易被患者和醫(yī)生忽略。常見的影像學(xué)檢查，如腹部超聲、CT掃描、內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影（ERCP）、內(nèi)鏡下超聲（EUS）、核磁顯像等均為胰腺癌的診斷提供了一定程度的特異性和敏感性。不同的檢查方法所體現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)不同，B超無(wú)創(chuàng)、CT更精準(zhǔn)。相對(duì)于其他檢測(cè)方法，腫瘤標(biāo)志物不僅可以用于早期診斷，還對(duì)于評(píng)價(jià)治療效果、預(yù)后評(píng)估同樣很重要。因?yàn)槟[瘤標(biāo)志物與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，且隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因標(biāo)志物、表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物等分子生物技術(shù)及生物信息學(xué)方面的發(fā)展，為胰腺癌的診斷，尤其是早期診斷、評(píng)估和預(yù)后提供了可能途徑。對(duì)于小于3 cm的胰腺癌腫塊的診斷及鑒別診斷往往是困難的，目前的診斷方法中，ERCP、EUS等其技術(shù)依賴性強(qiáng)；胰腺取活檢雖準(zhǔn)確率高，但因有創(chuàng)及難度高，得到普及和臨床應(yīng)用均較困難，而止電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET）理論上能夠診斷胰腺早期腫瘤，但高費(fèi)用限制了其在臨床的應(yīng)用。目前，臨床上常用的胰腺癌血清學(xué)標(biāo)志物CA19-9，有文獻(xiàn)指出其在鑒別胰腺的良惡性腫塊方面作用有限，而且對(duì)小于3 cm的胰腺癌敏感性只有50%，在膽道梗阻、肝硬化、慢性胰腺炎等疾病中血清水平也可明顯升高[5-6]。同時(shí)現(xiàn)有的CA19-9多個(gè)商業(yè)試劑盒沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果常存在差異[7]。因此，當(dāng)前的檢查方法不能滿足胰腺癌早期診斷的需要。因此，發(fā)展新的腫瘤標(biāo)志物已成為全球研究熱點(diǎn)。

2 胰腺癌生物標(biāo)志物的現(xiàn)狀及研究進(jìn)展

2.1 蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物 目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離、鑒定胰腺癌患者血清、胰腺癌組織細(xì)胞、胰液及胰腺癌細(xì)胞系中的差異蛋白質(zhì)，是尋找潛在的高性價(jià)比胰腺癌早期腫瘤標(biāo)志物的有效途徑。

蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物相比其他檢測(cè)方法，具有創(chuàng)傷小、易于隨訪、患者依從性高等優(yōu)點(diǎn)。目前，臨床上常用的胰腺癌血清蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物如CA19-9、CA242、癌胚抗原（CEA）等，CA19-9、CA242、CEA 的敏感度均不超過(guò)80%，特異性也不盡如人意[8]，因此需要改進(jìn)檢測(cè)技術(shù)或用新的腫瘤標(biāo)志物來(lái)取代它們。

由于胰腺癌患者的預(yù)后較差，因此大量的研究致力于尋找更好的生物標(biāo)志物。KOSANAM等[9]對(duì)比了4對(duì)PDAC癌組織及癌旁良性胰腺組織蛋白質(zhì)表達(dá)差異，共鑒別出了2 190種無(wú)重復(fù)蛋白質(zhì)。大量的蛋白質(zhì)在胰腺癌組織及正常組織存在表達(dá)譜的顯著差異，提示大量潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，人層粘連蛋白亞基γ?2（LAMC2）在胰腺癌患者血清中顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在來(lái)自不同地區(qū)、不同年齡組的健康人、良性胰腺腫瘤及胰腺導(dǎo)管腺癌患者中進(jìn)行了較大規(guī)模的驗(yàn)證，結(jié)果表明，LAMC2表達(dá)水平在早期PDCA人群中顯著增加，其敏感度接近于CA19-9，能區(qū)分早期PDCA患者與健康患者[曲線下面積（AUC）＞0.8]。此外，LAMC2 在 CA19-9 不高的胰腺導(dǎo)管癌人群中陽(yáng)性率為65%，提示LAMC2在診斷早期PDCA方面可成為CA1-9的良好補(bǔ)充。LAMC2是目前公認(rèn)的、有前途的、新的胰腺癌早期診斷生物標(biāo)志物。CHAN等[10]的一項(xiàng)回顧性盲評(píng)研究也驗(yàn)證了CA19-9及LAMC2聯(lián)合使用優(yōu)于單獨(dú)使用CA19-9，尤其是在PDCA早期診斷方面。

多項(xiàng)研究表明，多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合使用其敏感性和特異性優(yōu)于單獨(dú)使用CA19-9。有研究發(fā)現(xiàn)，CA19-9、CA242、CA50等腫瘤標(biāo)志物采取2個(gè)或3個(gè)聯(lián)合檢測(cè)可提高靈敏度及特異度[11]，有助于早期診斷。GU等[12]還研究了聯(lián)合CA19-9、CA242、CA125和CEA的影響。單獨(dú)使用時(shí)，CA19-9敏感度最高（82.7%），但CA242有最高的特異度（90%）。當(dāng)4個(gè)標(biāo)志物相結(jié)合時(shí)，靈敏度上升到90.4%，特異度上升到93.8%。然而，不清楚的是如何將這4個(gè)標(biāo)志物結(jié)合在一起，文章中未提到具體的公式。然而，這些組合蛋白質(zhì)標(biāo)志物只是在單個(gè)機(jī)構(gòu)中進(jìn)行了評(píng)估，需要在不同機(jī)構(gòu)間進(jìn)行更廣泛的驗(yàn)證。

SINGH等[13]研究發(fā)現(xiàn)，P38β蛋白水平在胰腺癌中比慢性胰腺炎患者及正常對(duì)照組相比高2倍，且于早期化療后出現(xiàn)水平下降，對(duì)于胰腺癌及其他胰腺疾病有較好區(qū)分性及監(jiān)測(cè)胰腺癌療效可行性，且表面等離子共振技術(shù)已用于血清P38β蛋白水平量化，為P38β蛋白廣泛使用和在抗癌治療不同階段及療效監(jiān)測(cè)方面提供了可能。雖然這些標(biāo)志物理論上可以提高胰腺癌的檢出率，但是否適用于實(shí)際篩查或早期評(píng)估診斷還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

胰液中含有豐富的蛋白質(zhì)物質(zhì)，可能存在潛在的腫瘤標(biāo)志物。DOYLE等[14]、CHEN等[15]對(duì)胰腺癌胰液中蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定、分析，發(fā)現(xiàn)不同疾病，包括胰腺癌、胰液中蛋白質(zhì)呈差異表達(dá)。提示在尋找胰腺癌早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物方面，胰液是一個(gè)重要標(biāo)本。

近年來(lái)，在胰腺癌癌細(xì)胞中的研究也取得較大的進(jìn)展。不同于胰腺癌組織，胰腺癌癌細(xì)胞株作為體外一個(gè)穩(wěn)定組織，且可重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可進(jìn)行篩選胰腺癌早期診斷腫瘤標(biāo)志物。ZHONG等[16]利用免疫組化分析證實(shí)一種線粒體膜蛋白抗增殖蛋白（PHB-1）與胰腺癌腫瘤細(xì)胞分化有關(guān)，在分化良好的胰腺癌組織中比在正常胰腺組織中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究表明，PHB-1與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)，具有抗癌特性，其可能是一個(gè)有前景的腫瘤標(biāo)志物，但進(jìn)一步的研究仍需要研究者繼續(xù)努力。

2.2 表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物 新型腫瘤標(biāo)志物還包括血清遺傳物質(zhì)的檢測(cè)，表觀遺傳改變而不影響基因表達(dá)，包括DNA轉(zhuǎn)錄水平變化、微小RNA（miRNA）表達(dá)譜的變化和組蛋白的各種修飾。表觀遺傳學(xué)改變發(fā)生在腫瘤發(fā)生的最早階段，為疾病的檢查和診斷提供了新的方法[17]。目前，還沒有一種理論統(tǒng)一所有的表觀遺傳途徑，因此對(duì)于胰腺癌表觀遺傳變異有多種監(jiān)測(cè)和檢測(cè)方法。

2.2.1 DNA甲基化 基因異常常表現(xiàn)為DNA甲基化。DNA異常甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，能造成相關(guān)基因功能丟失或增加。在人類基因組中的DNA甲基化多數(shù)發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶。關(guān)于DNA甲基化用于檢測(cè)胰腺癌已有多個(gè)研究報(bào)道。PEDERSEN等[18]分析132例胰腺癌患者和60例健康對(duì)照者的外周血白細(xì)胞DNA，發(fā)現(xiàn)110個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平有顯著差異（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05）。再經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)CpG位點(diǎn)（LCN2_P86_R、LCN_P141_R）的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)顯示胰腺癌患者比對(duì)照組的甲基化水平明顯降低。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，胰腺癌患者和對(duì)照組之間確實(shí)存在甲基化差異，這為設(shè)計(jì)基于甲基化的早期癌癥檢測(cè)和甚至風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的原理提供了支持。

有研究報(bào)道，通過(guò)檢測(cè)及分離胰腺癌腫瘤組織，已經(jīng)確定了一組存在甲基化異常和基因沉默的基因，包括TSLC1、P16等[19-20]。這些有潛力的標(biāo)志物，如果在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證和改進(jìn)，期望應(yīng)用于一個(gè)可行的篩查方案，無(wú)論是高危人群，還是一般人群，都能在潛在的治療階段早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌。

2.2.2 無(wú)細(xì)胞核小體 核小體是有重復(fù)亞基的DNA和組蛋白構(gòu)成的人類染色體。釋放至血清或血漿中的完整核小體可以作為潛在的診斷疾病的生物標(biāo)志物。無(wú)細(xì)胞核小體升高已在各種癌癥包括胰腺癌[21-22]被報(bào)道。PDAC和對(duì)照組之間的血清無(wú)細(xì)胞核小體水平和表觀遺傳分布存在差異。這種差異可能被應(yīng)用于胰腺癌的早期檢測(cè)[23]。雖然沒有單一的無(wú)細(xì)胞核小體作為胰腺癌腫瘤標(biāo)志物優(yōu)于CA19-9，但聯(lián)合這些標(biāo)志物CA19-9可產(chǎn)生高敏感性和特異性。因此，假設(shè)有更廣泛的檢測(cè)可行，這些表觀遺傳標(biāo)志物在診斷尚無(wú)臨床癥狀出現(xiàn)的胰腺癌患者方面可能是有用的。

2.2.3 miRNA miRNA由長(zhǎng)約19～25個(gè)核苷酸、非編碼RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因所表達(dá)。miRNA的下調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[24]。miRNA通過(guò)下調(diào)mRNA來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，從而減少基因轉(zhuǎn)化為效應(yīng)蛋白。由于miRNA是從DNA轉(zhuǎn)錄的，它們受DNA甲基化和組蛋白乙?；{(diào)節(jié)。因此，miRNA和表觀遺傳控制形成反饋回路以維持正常的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。SCHULTZ等[26]的一項(xiàng)研究確定了2種全血中的診斷miRNA芯片，它們能夠在一定程度上區(qū)分健康人和胰腺癌患者，與REN等[27]研究結(jié)果一致。同時(shí)REN等[27]還發(fā)現(xiàn)miR-196a的表達(dá)水平與胰腺癌直徑呈明顯相關(guān)性。這提示miRNA可能成為早期胰腺癌診斷的可靠腫瘤標(biāo)志物，當(dāng)然在廣泛臨床使用之前，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2.4 無(wú)細(xì)胞腫瘤DNA 無(wú)細(xì)胞核酸包括無(wú)細(xì)胞DNA，是另一種基于液體活檢的新技術(shù)，已被用于胰腺癌的研究。對(duì)胰腺癌患者的初步研究表明，無(wú)細(xì)胞DNA的變化可出現(xiàn)在常規(guī)影像學(xué)改變之前[28]。如果這在一項(xiàng)正在進(jìn)行的研究中得到驗(yàn)證，無(wú)細(xì)胞DNA有望成為臨床決策和臨床研究的敏感性、特異性和非侵入性工具。

2.3 其他生物標(biāo)志物 其他作為PDAC診斷的生物標(biāo)志物包括抗體、代謝產(chǎn)物、基因突變、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和口腔微生物組等[29]，如補(bǔ)體13[30]、離子結(jié)合蛋白1[31]等，包括基因標(biāo)志物。胰腺癌的發(fā)生是多基因逐步積累的結(jié)果[32]，同時(shí)在幾乎所有的胰腺癌前病變中均可識(shí)別KRAS基因突變，如胰腺上皮內(nèi)瘤樣病變、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤和黏液性囊性腫瘤[33-36]，這提示基因標(biāo)志物在胰腺癌的早期診斷中存在巨大前景。但是，這些新型生物標(biāo)志物是否能代替CA19-9用于臨床檢測(cè)胰腺癌，甚至是早期胰腺癌還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，胰腺癌是一種預(yù)后極差的致命疾病，尤其是在晚期診斷時(shí)。目前，還沒有適合一般人群的有效篩查方法。在早期階段檢測(cè)胰腺癌主要集中在高危人群，包括胰膽管成像、ERCP等。這些影像學(xué)檢查的成本和侵入性使得這種策略不能用于中度風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體（如成年發(fā)病糖尿病患者）和普通人群。雖然許多生物標(biāo)志物仍在發(fā)展初期，但初步的研究結(jié)果是有希望的，表明這些方法可能會(huì)在未來(lái)改進(jìn)和促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的早期檢測(cè)。同時(shí)，非生物標(biāo)志物聯(lián)合生物標(biāo)志物進(jìn)行胰腺癌早期檢測(cè)也在發(fā)展中。如鑒于95%胰腺癌患者均存在KRAS2基因突變，已嘗試使用PET和突變型KRAS2肽核酸突變KRAS2基因激活圖像[37-38]。相信隨著影像學(xué)技術(shù)和胰腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的發(fā)展，結(jié)合胰腺癌高危人群的隨診，胰腺癌的早期診斷和整體預(yù)后能夠有效改善。