重慶地區(qū)HBV基因型群體遺傳學(xué)研究*

李 甜，覃 英，胡 渝（重慶市人民醫(yī)院400014）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球分布趨勢(shì)，是世界性公共衛(wèi)生疾病之一，也是危害中國(guó)公共衛(wèi)生健康的疾病重要之一[1]。本研究中，通過(guò)對(duì)重慶市HBV病毒情況進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，探討重慶地區(qū)HBV病毒的群體遺傳多樣性，進(jìn)一步判斷重慶市HBV群體擴(kuò)張趨勢(shì)，最終預(yù)測(cè)重慶地區(qū)HBV病毒爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇重慶市范圍內(nèi)8個(gè)不同的區(qū)（黔江區(qū)、萬(wàn)州區(qū)、南川區(qū)、涪陵區(qū)、北碚區(qū)、墊江縣、合川區(qū)和沙坪壩區(qū)），收集HBV感染患者的血清，患者入院時(shí)間為2014年1—12月，患者戶(hù)籍為重慶且長(zhǎng)期居住在重慶，排除標(biāo)準(zhǔn)為患有其他類(lèi)型肝炎。血清分離后使用干冰運(yùn)輸，保存在?80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 使用E?CyclerTM 96聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（北京博奧生物有限公司）。由上海PerkinElmer提供磁珠法提取HBV DNA試劑盒。德國(guó)Qiagen公司提供PCR擴(kuò)增試劑。華大基因提供PCR引物（10μmol/L），引物序列如下：5′?GCGGGGTTTTTCTTGTTGA?3′，5?GGGACTCAAGATGTTGTACAG?3′。

1.2.2 研究方法

1.2.2.1 標(biāo)本處理及檢測(cè) 使用上海鉑金埃爾默生物科技有限公司試劑盒（磁珠法）進(jìn)行提取。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，52℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由華大基因測(cè)序。

1.2.2.2 HBV 群體遺傳學(xué)分析 使用MEGA6.0軟件計(jì)算堿基組成、保守及變異堿基位點(diǎn)等[2]。使用DNAspv5.0軟件[3]計(jì)算單倍型多肽性（h）、單倍型數(shù)量（hap）和核苷酸多肽性（p）。使用軟件DNAspv5.0計(jì)算Fu's Fs值及Tajima's D值，并構(gòu)建錯(cuò)配分布。若HBV有效種群保持穩(wěn)定，則核酸的錯(cuò)配分布曲線(xiàn)呈現(xiàn)出多峰曲線(xiàn)分布，同時(shí)Fu's Fs和Tajima D值檢驗(yàn)不顯著。若群體經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張，則核酸的錯(cuò)配分布曲線(xiàn)呈單峰倒鐘形分布[4]，F(xiàn)u's Fs中性檢驗(yàn)和Tajima D值同時(shí)偏離中性突變。使用軟件BEAST v1.7.1分析群體增長(zhǎng)時(shí)間和擴(kuò)張情況，分析各地區(qū)各基因型貝葉斯輪廓圖（BSP）。B和C基因型的平均進(jìn)化速度分別定義為：（7.72±5.00）×10?4位點(diǎn)/年，（3.73±2.10）×10?4位點(diǎn)/年[5-6]。使用 10 000 000代蒙特卡羅（MCMC），對(duì)每1 000代進(jìn)行抽樣，計(jì)算得到10 001棵系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。比較分析MCMC的log文件與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用Tracer 1.5軟件分析群體的有效大小[采用95%最大后驗(yàn)密度（HPD）]和擴(kuò)張時(shí)間，并生成貝葉斯輪廓圖[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量資料以表示，采用t檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料以表示，采用χ2檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果 把HBVS基因所測(cè)序列與A-H型參考序列[8]（來(lái)自NCBI）進(jìn)行比對(duì)，剔除比對(duì)不能滿(mǎn)足要求的前后各一段序列，最終B型堿基數(shù)量為531bp的序列長(zhǎng)度用于系統(tǒng)發(fā)育分析。B型基因組成為A（19.2%）、T（31.8%）、C（27.9%）、G（21.1%）。C型堿基長(zhǎng)度525 bp，組成為A（18.1%）、T（31.9%）、C（28.6%）、G（21.4%）。比對(duì)后B基因型的變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別為189、339、66、123個(gè)。C基因型包括變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別為189、339、66、123個(gè)。用本研究獲得的528個(gè)HBV S基因序列及A-H型的參考序列（從NCBI網(wǎng)站上獲得）構(gòu)建得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)上各節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值為自展分析值，發(fā)育可信時(shí)自展分析值大于90%。用Kimura 2-parameter模型計(jì)算并以堿基替換為單位來(lái)決定樹(shù)枝長(zhǎng)短，以推斷樹(shù)的進(jìn)化距離。本研究中所得的基因序列主要構(gòu)建分為B、C和D基因型，3個(gè)基因型自展分析值均大于90%。

2.2 HBV群體遺傳學(xué)結(jié)果 B型的HBV序列共有346條，并含有250個(gè)單體型；C型HBV序列共有181條，包含163個(gè)單體型。各地區(qū)分布表1所示。各地區(qū)C型的核苷酸多態(tài)性（π）和單倍型多態(tài)性（h）均比B型的更高。（見(jiàn)表1）。

3 討 論

分子遺傳學(xué)是以核酸序列變異為基礎(chǔ)，以研究群體遺傳結(jié)構(gòu)，以及群體遺傳結(jié)構(gòu)與其影響因素的相互關(guān)系為研究目的。其主要衡量指標(biāo)是基因同源序列的遺傳分化程度。群體遺傳結(jié)構(gòu)主要影響因素包括基因重組、基因突變、基因轉(zhuǎn)換等。群體遺傳學(xué)研究一般是運(yùn)用軟件分析群體基因及基因型頻率等數(shù)據(jù)，并構(gòu)建相關(guān)模型[9]。

在中國(guó)，HBV主要為B和C型[10?12]。本課題組的前期研究證實(shí)墊江地區(qū)的HBV感染者B型和C型HBV有效種群大小在過(guò)去5年中經(jīng)歷過(guò)一次較大的擴(kuò)張，提示HBV在該地區(qū)爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)非常大[13]；在另一項(xiàng)使用類(lèi)似研究方法的研究表明，柳州地區(qū)HBV擴(kuò)張速度較為緩慢[14]。本研究中，通過(guò)對(duì)HBV進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，分析重慶地區(qū)HBV不同群體的遺傳多樣性，從而判斷重慶地區(qū)HBV群體擴(kuò)張情況，最終判斷HBV爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中樣本來(lái)自重慶8個(gè)地區(qū)中528個(gè)HBV感染血清中HBV S基因序列，并對(duì)群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，346個(gè)B型S基因樣本中含有189個(gè)突變位點(diǎn)和250個(gè)單倍型（hap）。單倍型多態(tài)性（h）0.978，分布范圍0.895～0.999。核苷酸多態(tài)性（π）0.016 44，分布范圍0.026 28～0.006 94。181個(gè)C型S基因樣本中共150個(gè)突變位點(diǎn)、163個(gè)單倍型，h為0.999，分布范圍0.992～1.000；核苷酸多態(tài)性為0.020 51，分布范圍0.017 88～0.026 04。單倍型多態(tài)性和單倍型越高，表明群體遺傳多樣性豐富及種群越大，其生存能力也更強(qiáng)。本研究中HBV B型和C型單倍型多態(tài)性和單倍型均高，且C型高于B型，表明C型具有更強(qiáng)的生存能力。

為了分析HBV群體擴(kuò)張的情況，作者使用了多種研究工具，包括Fu's Fs中性檢驗(yàn)法、核苷酸錯(cuò)配分布、BSP及Tajima's D中性檢驗(yàn)法，從而多角度分析。Fu's Fs中性檢驗(yàn)法主要反應(yīng)的是種群的近期事件。若Fu's Fs值的負(fù)值增大，表明種群近期突變累積較多。種群的古老突變主要使用Tajima's D中性檢驗(yàn)法顯示，Tajima's D值對(duì)種群事件反應(yīng)較長(zhǎng)。雖然HBV屬于DNA病毒，但逆轉(zhuǎn)錄酶校正功能缺乏，因而其比RNA病毒進(jìn)化速度更快。有研究表明，HBV的進(jìn)化速度為7.72×104位點(diǎn)/年[7]，高于人類(lèi)T細(xì)胞白血病病毒[15]，高速進(jìn)化的結(jié)果導(dǎo)致HBV感染宿主后高速擴(kuò)張。BSP分析結(jié)果顯示，重慶地區(qū)HBV B型與C型10年中曾經(jīng)發(fā)生過(guò)快速擴(kuò)張，甚至某些地區(qū)擴(kuò)張達(dá)到10倍。僅少部分地區(qū)（黔江區(qū)、合川區(qū)、沙坪壩區(qū)）的HBV C型擴(kuò)張不明顯。HBV B與C基因型均呈典型倒鐘形分布，沙坪壩區(qū)、合川區(qū)及黔江區(qū)呈現(xiàn)多峰分布。加上Tajima's D值及Fu's Fs值結(jié)果均顯示為負(fù)值，且Fu's Fs值的趨勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Tajima's D值，提示HBV種群擴(kuò)張主要發(fā)生在近期，與BSP分析結(jié)果一致。目前，重慶市區(qū)域內(nèi)HBV種群擴(kuò)張的原因仍然不明確。BSP圖分析顯示擴(kuò)張時(shí)間發(fā)生在2008年后，因而推測(cè)2008年汶川大地震一個(gè)非?？赡艿脑颉＠?，災(zāi)民的遷移及地震治療不及時(shí)，均有可能導(dǎo)致HBV群體的擴(kuò)張。本研究結(jié)果顯示，HBV群體有效種群大小呈現(xiàn)繼續(xù)擴(kuò)張的趨勢(shì)，因此建議重慶地區(qū)對(duì)HBV感染控制方面采取更多、更有效的措施，并有必要組織大型的分子流行病學(xué)研究，并對(duì)HBV的爆發(fā)做好預(yù)警工作。