同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) 在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

哈斯來提阿依·買買提 胡昕 齊曼古力·吾守爾

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的危害人類身心健康的呼吸道傳染性疾病[1]。WHO[2]在《2017年全球結(jié)核病報(bào)告》中指出，全球新增結(jié)核病患者1040萬例，死亡患者達(dá)170萬例，結(jié)核病成為了全球第九大致死性疾病[3]。近幾年，隨著耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的暴發(fā)流行，結(jié)核病并發(fā)HIV感染者增多，使我國(guó)結(jié)核病疫情再度回升。據(jù)WHO[2]估算，2017年全球MDR-TB新發(fā)患者約49萬例；我國(guó)作為全球27個(gè)MDR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家[4]，新發(fā)MDR-TB患者例數(shù)僅次于印度[2]。因此，早期發(fā)現(xiàn)、干預(yù)、治療依舊是我國(guó)控制結(jié)核病工作的重點(diǎn)。

結(jié)核病診斷方法及血清蛋白質(zhì)組學(xué)來源

一、常用結(jié)核病診斷方法

結(jié)核病常用診斷方法有實(shí)驗(yàn)室檢查法，如痰涂片法；此方法雖操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)，但陽性率僅為20%～30%[5]。相比之下，痰培養(yǎng)成了診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，提供了比痰涂片更高的陽性率(30%～40%)[5]；但培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，不能用于結(jié)核病的早期、快速診斷。結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD)試驗(yàn)，在診斷結(jié)核病中漏診率可達(dá)18.3%[6]；甚至在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、免疫力低下、應(yīng)用免疫抑制劑、百日咳、麻風(fēng)等患者中可出現(xiàn)假陰性[7]。影像學(xué)檢查法，如X線胸部攝影，對(duì)于微小病灶檢出率低，胸部CT檢查能彌補(bǔ)以上缺陷，被看作診斷結(jié)核病常用的檢查手段而廣泛使用。因結(jié)核病病灶在影像學(xué)上表現(xiàn)多樣化，容易與肺炎、慢性阻塞性肺疾病等混淆。分子生物學(xué)檢查，如熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorosence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)法[8]，其陰性預(yù)測(cè)值只有49.1%。因此，迫切需要找出既快速又準(zhǔn)確的結(jié)核病診斷方法。

二、血清蛋白質(zhì)組學(xué)來源

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們將結(jié)核病診斷的重點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向能反映機(jī)體狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。1991年Nagai 等[9]首次應(yīng)用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技術(shù)，對(duì)MTB H37Rv菌株2～10周培養(yǎng)濾液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，拉開了MTB蛋白質(zhì)組學(xué)研究的序幕。其中，同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative absolute quantitation，iTRAQ)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2DLC-MS/MS)，即iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)因分離能力強(qiáng)、分析范圍廣、敏感度高、特異度高、自動(dòng)化程度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，受到研究人員關(guān)注并逐漸得到廣泛使用。

血清蛋白質(zhì)組學(xué)概述

血清蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上是指在大規(guī)模水平上研究血清中蛋白質(zhì)特征的一門學(xué)科。當(dāng)機(jī)體受刺激或生理功能發(fā)生變化時(shí)，血清蛋白也隨著出現(xiàn)相應(yīng)變化。血清蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種整體、動(dòng)態(tài)、定性、定量、全面分析蛋白質(zhì)的功能、組成及相互關(guān)系的一門學(xué)科，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的血清蛋白標(biāo)志物有重大意義。Li等[10]運(yùn)用iTRAQ技術(shù)[11]聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜[12](matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)來研究結(jié)核病患者和健康人群血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone binding globulin，SHBG)可作為結(jié)核病潛在診斷性血清學(xué)標(biāo)志物。Wang等[13]運(yùn)用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CD44、激肽原1重組蛋白(recombinant kininogen 1,KNG1)含量在MDR-TB患者血清中明顯升高，可作為診斷MDR-TB潛在的血清蛋白標(biāo)志物。其中，iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)因分離能力強(qiáng)、分析范圍廣、敏感度高、特異度高、檢測(cè)限低、自動(dòng)化程度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，受到研究人員的關(guān)注并使用。

iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)原理

iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)是指將iTRAQ與2DLC-MS/MS技術(shù)相聯(lián)用，用核素標(biāo)簽的方法對(duì)復(fù)雜組分的蛋白樣本進(jìn)行分析研究的新型技術(shù)。其基本原理是先根據(jù)TRAQ[14]技術(shù)原理將試劑與賴氨酸側(cè)鏈或肽段的N端發(fā)生反應(yīng)，完成對(duì)肽段的標(biāo)記，然后再利用2DLC-MS/MS[15]技術(shù)將血清樣品分子進(jìn)行離子化，并根據(jù)質(zhì)荷比差異來分離，最終得到蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。其中TRAQ技術(shù)可標(biāo)記相對(duì)分子質(zhì)量8000～280 000(8～280 kD)[16]的蛋白，甚至可靈敏地檢測(cè)跨膜蛋白，被用于研究宮頸癌[17]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[18]、肝細(xì)胞癌[19]等多種疾病的生物標(biāo)志物。2DLC-MS/MS[15]技術(shù)可對(duì)肽及蛋白質(zhì)的氨基酸序列及相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量，并分析蛋白質(zhì)翻譯后的修飾過程。當(dāng)同位素標(biāo)記與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用時(shí)，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比的峰，根據(jù)峰值可得到蛋白質(zhì)的定量信息[20]，不僅定量結(jié)果精確，且穩(wěn)定性好[21]，非常適合對(duì)多樣本進(jìn)行平行分析，應(yīng)用于HIV并發(fā)肺結(jié)核[22]、前列腺癌[23]等多種疾病血清蛋白標(biāo)志物的研究。

iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)在結(jié)核病血清蛋白質(zhì)組學(xué)中的研究和應(yīng)用

疾病的發(fā)生和發(fā)展涉及蛋白質(zhì)水平的變化。MTB感染可通過多種途徑在血液循環(huán)中引起結(jié)核病相關(guān)蛋白的變化。因此，血清蛋白也可以反映結(jié)核病患者的病理狀態(tài)。因這些特點(diǎn)，越來越多的學(xué)者開始尋找結(jié)核病相關(guān)血清蛋白標(biāo)志物，以提高結(jié)核病的診斷準(zhǔn)確率。

一、iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

目前，iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)因較高的敏感度及特異度被眾多研究者們關(guān)注。江婷婷[16]研究選取了136例肺結(jié)核患者及66名健康人群血清標(biāo)本，進(jìn)行脫鹽、濃縮、還原、消化等處理后，用iTRAQ同位素標(biāo)記聯(lián)合2DLC-MS/MS技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行分析，最終選取維生素K依賴蛋白Z(human vitamin K-dependent protein Z，PROZ)、淀粉樣蛋白A(serum amyloid protein A，SAA)和C4b結(jié)合蛋白β鏈(human C4b-binding protein beta chain，C4BPB)等在肺結(jié)核與健康人群血清中表達(dá)差異的蛋白，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法對(duì)差異蛋白行后續(xù)驗(yàn)證，構(gòu)建含有驗(yàn)證蛋白質(zhì)的結(jié)核病決策樹。得出該診斷模型的準(zhǔn)確率為97.2%，敏感度為97.06%，特異度為95.45%。因此，認(rèn)為SAA、PROZ和C4BPB可能是肺結(jié)核的新型潛在診斷性生物標(biāo)志物。Xu等[24]將結(jié)核病患者及健康人血清進(jìn)行iTRAQ-2DLC-MS/MS分析比較，獲得載脂蛋白II(apolipoprotein II，APOCII)、人CD5分子樣蛋白(human CD5 molecular protein，CD5L)、重組人視黃醇結(jié)合蛋白(recombinant human retinol binding protein，RBP4)等兩組人群血清中表達(dá)差異的蛋白。以蛋白質(zhì)構(gòu)建最優(yōu)分類樹診斷模型，該模型篩檢的敏感度、特異度分別為93.42%、92.86%，對(duì)于結(jié)核病的診斷有一定的參考價(jià)值。

二、iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)在結(jié)核病及其他肺部疾病鑒別中的應(yīng)用

肺炎和慢性阻塞性肺疾病也可能出現(xiàn)與活動(dòng)性肺結(jié)核相似的常見癥狀，如胸痛、咳痰、發(fā)熱和盜汗等。當(dāng)痰涂片陰性時(shí)，痰培養(yǎng)成為主要診斷方法，但其所需時(shí)間長(zhǎng)(約需4～8周)。盡管近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)已被開發(fā)用于診斷結(jié)核病，但使用該技術(shù)時(shí)，在支氣管癌患者和有結(jié)核病病史的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了假陽性結(jié)果[11]。為了解決這些缺陷，Xu等[25]運(yùn)用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)分析、篩選和鑒定結(jié)核病、肺炎、肺癌患者及健康人血清標(biāo)本，最終發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、鈣粒蛋白(calcareous protein，S100A9)和胞外超氧化歧化酶重組蛋白(extracellular superoxide dismutase recombinant protein，SOD3)含量在結(jié)核病患者血清中明顯升高。用三者建立診斷模型，可將結(jié)核病與肺炎、肺癌鑒別開來。該模型鑒別結(jié)核病與肺炎、結(jié)核病與肺癌患者的敏感度分別為90%、85%。特異度分別為87.05%、90.05%；江婷婷[16]報(bào)告，采用上述技術(shù)鑒定和分析初治活動(dòng)性肺結(jié)核、肺炎、慢性阻塞性肺疾病患者血清標(biāo)本，并將篩檢出的SAA、PROZ、C4BPB表達(dá)差異的蛋白組成決策樹，該模型鑒別診斷初治肺結(jié)核與肺炎的準(zhǔn)確度為85.2%，敏感度為95.60%，特異度為71.40%；與慢性阻塞性肺疾病鑒別的準(zhǔn)確度為69.30%，敏感度為100.00%，特異度為72.50%。最終認(rèn)為，三者可能是結(jié)核病潛在的血清生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)利用上述標(biāo)記物可以鑒別結(jié)核病及其他肺部疾病。

三、iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)在結(jié)核病發(fā)展過程中的應(yīng)用

血清蛋白標(biāo)志物可能參與結(jié)核病患者潛伏期、活動(dòng)期、轉(zhuǎn)歸期過程。血清或血漿蛋白水平的微量變化可提示機(jī)體是否處于MTB潛伏感染狀態(tài)?；顒?dòng)性結(jié)核病患者病灶處于開放狀態(tài)，MTB繁殖活躍、毒力強(qiáng)。Xu等[24]應(yīng)用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)，分析活動(dòng)性肺結(jié)核患者及健康人血清蛋白，最終獲得載脂蛋白cⅡ、類 CD5 抗原、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白2、視黃醇結(jié)合蛋白4、血清淀粉樣蛋白 A4和血漿酶原結(jié)合蛋白等血清蛋白標(biāo)志物；Wang等[26]對(duì)規(guī)律抗結(jié)核治療后患者及健康對(duì)照組血清進(jìn)行分析，最終發(fā)現(xiàn)蛋白、解離抑制因子β、補(bǔ)體C3、纖維黏膠蛋白2、脂蛋白a水平較健康人群顯著升高，認(rèn)為這5種蛋白可能是治療后結(jié)核病患者的血清蛋白標(biāo)志物。

結(jié) 論

結(jié)核病作為古老的傳染性疾病，早期發(fā)現(xiàn)和診斷依然是有效控制結(jié)核病的首要任務(wù)。血清蛋白質(zhì)組學(xué)以高敏感度和特異度開始受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。結(jié)核病血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果初步顯示，運(yùn)用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)鑒定、分析結(jié)核病相關(guān)血清蛋白標(biāo)志物，對(duì)診斷結(jié)核病具有較高的敏感度和特異度。當(dāng)然這些特異血清蛋白標(biāo)志物在不同類型結(jié)核病患者血清中表達(dá)水平有無差異，需要進(jìn)行更深層次的研究。不可忽視的是，檢測(cè)血清中結(jié)核病有關(guān)差異蛋白雖然具有高的敏感度和特異度，但是距離臨床應(yīng)用還需要很長(zhǎng)一段時(shí)間，需要科學(xué)工作者不斷印證并探索新型技術(shù)。目前iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)及有關(guān)肺外結(jié)核及其他傳染性疾病應(yīng)用血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究極少，這就需要科學(xué)工作者不斷探索更多肺外結(jié)核的相關(guān)標(biāo)志物，以確定肺結(jié)核與肺外結(jié)核蛋白標(biāo)記物有無差異，明確兩者之間有無關(guān)系。同樣，作為呼吸道傳染性疾病，血清蛋白標(biāo)志物與其他傳染性疾病之間有無關(guān)聯(lián)性，也有待做進(jìn)一步探索。