細菌超聲分散計數(shù)儀在微生物實驗前處理中的應用

馮通明 肖美方 王威 崔小穎 吳智龍 周杰

菌懸液制備是微生物學研究的一項基本實驗操作，尤其在開展致病菌的藥物敏感性試驗、菌種鑒定之前，通常需要對菌株或菌液進行預處理，使細菌分散呈單細胞狀態(tài)，或接近單細胞游離狀態(tài)，以便于后續(xù)實驗的進行[1-4]。傳統(tǒng)的菌懸液制備方法以反復吹打、渦旋振蕩、研磨法為主，而在臨床及科研工作中，經(jīng)常涉及到某些培養(yǎng)形態(tài)呈顆粒狀、皺褶干燥、黏稠拉絲、難分離的菌株，如諾卡菌屬、奈瑟菌屬、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等[5-7]，難以通過傳統(tǒng)手工方法獲得理想的菌懸液；此外，開放式操作容易產(chǎn)生大量氣溶膠，而研究對象通常具有一定的傳染性和致病性，對實驗人員的人身安全存在較大隱患[8]。因此，微生物學研究亟需安全、高效、標準化的菌懸液制備方法。

本研究采用細菌超聲分散計數(shù)儀，通過對比傳統(tǒng)的手工分散方法與新型的超聲分散方法這兩種菌懸液制備方法，借助革蘭染色鏡檢觀察比較二者的分散效果，并用平板計數(shù)法評價超聲分散處理對菌活性的影響，從而探究細菌超聲分散計數(shù)儀在微生物實驗前處理中的應用價值。

材料和方法

1. 實驗材料：本研究參試菌種共計9種，分別為鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、奈瑟菌屬(Neisseriaspp.)、諾卡菌屬(Nocardiaspp.)、人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)、玫瑰單胞菌(Roseomonassp.)和嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotro-phomonasmaltophilia)，均為佛山市第四人民醫(yī)院檢驗科提供。

2.儀器和試劑：BACspreaderTM2100型細菌超聲分散計數(shù)儀(廣東體必康生物科技有限公司，簡稱“分散儀”，中國)，光學顯微鏡(奧林巴斯，日本)，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒，中國)，4 ℃冰箱，微量移液器(Eppendorf公司，德國)等；LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)平板，接種環(huán)，0.5% Tween-80生理鹽水，超聲分散專用試管(廣東體必康生物科技有限公司，中國)，載玻片，革蘭染色液等。

3.實驗及評價方法：包括采用分散儀分散方法(簡稱“儀器分散法”)與傳統(tǒng)手工分散方法。(1)活化菌株：無菌條件下，用接種環(huán)分別將各菌種劃線接種到LB固體培養(yǎng)平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。(2)設定分散儀工作參數(shù)：以是否能肉眼觀察到顆粒物為標準，摸索不同菌株的超聲分散處理的條件，選取達到均勻、無明顯顆粒分散效果所需的最低超聲分散功率和處理時間，作為各菌種的儀器分散初始參數(shù)。(3)儀器分散法：用接種環(huán)挑取適量菌落分裝到3個裝有2 ml生理鹽水的超聲分散專用試管中，并設置3組重復，分別用分散儀的低檔、中檔和高檔功率進行超聲分散，每超聲處理5 s，間隔5 s，以此循環(huán)；隨時通過肉眼觀察菌液分散效果，當菌液呈均勻無明顯顆粒狀時即停止超聲處理，記錄各菌種適合的超聲分散工作時間和功率，并檢測菌液濁度，稀釋至1 麥氏濁度單位(MCF)。(4)傳統(tǒng)手工分散方法：采用反復吹打混勻法，用接種環(huán)挑取適量菌落至裝有2 ml生理鹽水的超聲分散專用試管中，并設置3組重復，用微量移液器反復吹打混勻，直至菌液呈均勻無明顯顆粒狀，并用分散儀檢測菌液濁度，稀釋至1 MCF。(5)分散效果評價方法：分別將儀器分散和手工分散獲得的菌懸液進行10倍梯度稀釋至1∶105，經(jīng)革蘭染色，在油鏡下觀察其分散效果。(6)菌液濁度評價方法：麥氏濁度直接反映菌懸液中活細胞的濃度，通常菌懸液越均勻，則濁度越穩(wěn)定且準確，因此濁度變化可以從側面反映菌液的均勻程度和儀器分散的分散效果。對各參試菌種分別設置3組重復，用分散儀進行超聲分散處理，其中，奈瑟菌屬和諾卡菌屬用中檔功率，其他菌種用低檔功率，每隔30 s記錄一次菌液濁度，最后取平均值繪制濁度與累積超聲分散時間的曲線圖。(7)細菌活性檢測和評價方法：采用平板計數(shù)法檢測并對比儀器分散和傳統(tǒng)手工分散兩種處理方法下細菌生長活性的差異，取兩種分散方法獲得的1∶105稀釋菌液各10 μl，分別涂布3個或6個LB固體培養(yǎng)平板，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24～48 h后統(tǒng)計各平板的菌落數(shù)，各參試菌種分別經(jīng)不同分散方法處理后，在同一稀釋度下進行劃板培養(yǎng)，通過平板計數(shù)法檢測其生長活性，對比分析不同分散方法對菌活性的影響。

4. 統(tǒng)計學處理：用Graphpad prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和制圖，使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，重復測量計量數(shù)據(jù)采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.分散儀工作參數(shù)對分散效果的影響：采用儀器分散法制備9種參試菌種菌懸液時，需使用低檔或中檔功率，其中7種菌只需使用低檔功率、2種菌需要使用中檔功率；除諾卡菌屬使用中檔超聲分散處理120 s外，其他各菌種超聲處理時間均不超過60 s，其中，大腸埃希菌需要的超聲時間最短，僅需10 s (表1)。

2. 不同處理方法對分散效果的影響：不同參試菌株經(jīng)手工分散獲得的菌懸液普遍存在不同程度的菌團聚等現(xiàn)象；分散儀對各參試菌種的分散效果更加均勻，無明顯菌團聚現(xiàn)象，部分菌種甚至呈單細胞游離狀態(tài)。兩種方法的分散效果差異最明顯的是奈瑟菌屬和諾卡菌屬，儀器分散法較傳統(tǒng)手工分散法能夠明顯提高細胞的分散程度；其次是人蒼白桿菌，儀器分散法能夠在一定程度上提高分散效果；而鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和嗜麥芽窄食單胞菌等菌株兩者的分散效果差異不明顯(圖1)。

3.超聲分散處理時間對菌液濁度的影響：隨著超聲分散時間的延長，大部分菌種的菌懸液濁度變化不明顯，以奈瑟菌屬為例，累積超聲分散時間從30 s到360 s，菌液濁度沒有發(fā)生明顯升高或降低，表明超聲處理30 s即可達到較為理想的分散效果；而鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌和大腸埃希菌的菌液濁度隨超聲分散時間的延長而明顯下降，表明在保證其分散效果的同時，應盡量縮短超聲時間；肺炎克雷伯菌較為特殊，當超聲處理60 s時，菌液濁度達到最大值，繼續(xù)延長處理時間，則濁度逐漸下降，見圖2。

不同分散方法對細菌生長活性的影響：在1∶105稀釋度下，大腸埃希菌經(jīng)儀器分散后的平板菌落數(shù)均值均明顯低于手工分散(P<0.05)，表明這種菌經(jīng)手工分散后的細菌生長活性明顯高于儀器分散；諾卡菌屬經(jīng)儀器分散后的平板菌落數(shù)均值明顯高于手工分散(P<0.05)，表明諾卡菌經(jīng)儀器分散后的細菌生長活性明顯高于手工分散；此外，鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、人蒼白桿菌和玫瑰單胞菌經(jīng)儀器分散后的平板菌落數(shù)均值均高于手工分散，而奈瑟菌屬和嗜麥芽窄食單胞菌經(jīng)儀器分散后的平板菌落數(shù)均值均低于手工分散，但均未達到顯著性水平。可以認為，上述6種菌種在指定條件下分別用儀器分散和手工分散獲得的菌懸液不存在明顯的生長活性差異，見表2。

表1 不同功率及累積超聲分散時間對各菌種的分散效果

注×：表示該條件下菌液分散效果未達到要求，需要延長超聲處理時間或提高超聲功率；√：表示該條件下菌液分散效果已達到要求；-：表示無數(shù)據(jù)，菌液分散效果已在更低超聲功率或更短超聲時間下達到要求

圖1 部分菌種(革蘭染色 ×1000)在不同處理方法下的分散效果。圖1A、B分別為奈瑟菌屬儀器分散與手工分散效果圖，顯示奈瑟菌屬經(jīng)儀器分散后的細胞分散程度明顯高于手工分散； 圖1C、D分別為諾卡菌屬儀器分散和手工分散效果圖，顯示諾卡菌屬經(jīng)儀器分散后的細胞分散程度明顯高于手工分散；圖1E、F分別為人蒼白桿菌儀器分散和手工分散效果圖，顯示儀器分散法在一定程度上提高人蒼白桿菌的分散效果；圖1G、H分別為鮑曼不動桿菌儀器分散和手工分散效果圖；圖1I、J分別為肺炎克雷伯菌儀器分散和手工分散效果圖；圖1K、L分別為嗜麥芽窄食單胞菌儀器分散和手工分散效果圖；圖1G～L顯示對于鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和嗜麥芽窄食單胞菌菌株，儀器分散法和手工分散法的分散效果差異不明顯

圖2 超聲分散處理時間對不同菌株懸液濁度的影響

細菌類別生長活性(×105 CFU/ml,x±s)分散儀法手工法F值P值鮑曼不動桿菌144±56130±220.3230.582陰溝腸桿菌60±1248±84.3560.063大腸埃希菌59±676±810.3210.033肺炎克雷伯菌131±19179±2315.5340.003奈瑟菌屬188±15236±1121.0870.322諾卡菌屬9±62±08.6930.015人蒼白桿菌277±93238±800.6200.449玫瑰單胞菌286±91280±1770.0060.941嗜麥芽窄食單胞菌85±7297±890.0700.797

注CFU為菌落形成單位

討 論

細菌超聲分散計數(shù)儀的工作原理是以液體為媒介，通過超聲波在液體中的“空化”作用，將聚集成團的菌落進行分散和解團聚，從而達到分散細菌的作用，小功率超聲有分散作用而無損于菌體，但大功率超聲可使細菌細胞破碎[3]。

本研究通過肉眼觀察、革蘭染色鏡檢、超聲時間與菌液濁度關系曲線作圖和平板計數(shù)法等實驗，對傳統(tǒng)手工分散方法和新型超聲分散方法這兩種菌懸液制備方法進行分散效果對比，并對比二者對細菌生長活性的影響。結果表明，與傳統(tǒng)手工分散方法相比，細菌超聲分散計數(shù)儀對各參試菌種的分散效果更加均勻，且耗時較短，在中檔或低檔功率下累積分散時間通常不超過120 s，在指定條件下不會影響菌體的生長活性。

菌懸液標本的制備是藥物敏感性試驗的關鍵步驟[9-12]。已有研究表明，細菌超聲分散計數(shù)儀在結核分枝桿菌的藥物敏感性試驗中具有極高的應用價值：傳統(tǒng)的研磨法分散效果不理想、操作復雜、人為誤差較大，而分散儀的超聲分散效果非常理想，且不影響細菌活力，更利于對藥物敏感性試驗結果的科學判讀，結果更具客觀性、可比性，能有效減少試驗誤差[3]。另外在體外試驗中，由于黏液型細菌，如銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌，產(chǎn)生大量藻酸鹽使其菌落表面覆蓋一層厚厚的黏液，致使制作菌懸液的過程中挑取大量的黏液而導致實際的菌液濃度偏低，是影響?zhàn)ひ盒图毦哪退幝拭黠@低于非黏液型細菌的重要因素[11]?？梢灶A見，細菌超聲分散計數(shù)儀在其他病原菌，尤其是某些難以手工分散的病原菌的藥物敏感性試驗及耐藥性檢測中具有極高的應用價值和潛力。此外，在病原菌的菌株分離和鑒定中，菌懸液制備同樣是關鍵步驟，細胞分散程度越接近單細胞游離狀態(tài)，越便于菌株的分離純化和后期鑒定[12]。

細菌超聲分散計數(shù)儀能夠解決某些菌種難以分散的難題，如諾卡菌屬、奈瑟菌屬、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌[3,13-15]等，同時，分散后可實現(xiàn)自動比濁，智能提示稀釋到標準麥氏濁度所需的稀釋體積等。此外，分散儀的工作環(huán)境相對密閉，能夠為實驗人員提供充足的健康安全保障；儀器參數(shù)設置固定、工作條件穩(wěn)定，具有可行性高、重復性好等優(yōu)勢，能夠為不同菌種的菌懸液制備提供一套標準化操作方法。

總之，分散計數(shù)儀能夠為菌懸液制備提供安全、高效、標準化的解決方案，在臨床及科研微生物實驗前處理中具有極高的應用價值，能夠替代傳統(tǒng)手工方法。