鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在竇房結(jié)中的生物學(xué)作用

聶大安 綜述 李景東 審校

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,湖北 武漢 430022)

竇房結(jié)(SAN)是哺乳動物心臟的正常起搏點(diǎn)，膜鐘學(xué)說和鈣鐘學(xué)說是目前SAN起搏的主流理論[1-2]。Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在SAN起搏過程中具有重要的調(diào)控作用[3]。本文將討論CaMKⅡ在SAN中的作用及其機(jī)制，并闡述CaMKⅡ在SAN功能障礙中的致病機(jī)制。

1 CaMKⅡ的生物學(xué)特性

CaMKⅡ是一種廣泛分布于人體內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族蛋白，包括α、β、γ、δ四種亞型；其中δ型是CaMKⅡ在心臟中表達(dá)的主要亞型，可分為CaMKⅡδB、CaMKⅡδC兩種剪接體。CaMKⅡδ由12個(gè)亞基組成，每個(gè)亞組又由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即氨基端的催化結(jié)構(gòu)域、羧基端的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及中間的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。其中，催化結(jié)構(gòu)域?yàn)榈孜锖虯TP結(jié)合部位，具有催化功能；調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域分為鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)和假底物區(qū)(或自身抑制區(qū))，能夠調(diào)節(jié)CaMKⅡ活性；結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠參與全酶的各亞基組裝過程及其亞細(xì)胞定位。在基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)域會抑制催化區(qū)的功能，使CaMKⅡ處于失活狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高后，Ca2+與鈣調(diào)素結(jié)合，形成鈣/鈣調(diào)復(fù)合物；繼而復(fù)合物與CaMKⅡ結(jié)合，將消除調(diào)節(jié)域的抑制性作用，使催化結(jié)構(gòu)域暴露，以催化下游靶蛋白磷酸化[4]，而調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能。

2 CaMKⅡ調(diào)節(jié)SAN起搏功能的機(jī)制

膜鐘學(xué)說和鈣鐘學(xué)說[2]涉及SAN細(xì)胞內(nèi)的諸多離子通道和信號調(diào)節(jié)蛋白。鈣鐘學(xué)說認(rèn)為，肌質(zhì)網(wǎng)(SR)的周期性局部鈣釋放可激活細(xì)胞膜上的鈉鈣交換器，后者在排出一個(gè)Ca2+的同時(shí)泵入三個(gè)Na+，形成內(nèi)向鈉鈣交換電流INCX，從而使細(xì)胞內(nèi)負(fù)性膜電位絕對值降低，并逐漸達(dá)到L型鈣通道的閾電位水平，誘發(fā)產(chǎn)生ICa-L，使細(xì)胞膜周期性舒張期自動除極[5]；膜鐘學(xué)說主張，SAN動作電位與超極化激活的內(nèi)向電流If有關(guān)，當(dāng)If激活后，以1∶3 到1∶5 的比率將細(xì)胞內(nèi)鉀離子排出細(xì)胞外和將細(xì)胞外鈉離子泵入細(xì)胞內(nèi)，其凈效應(yīng)為內(nèi)向電流，使細(xì)胞內(nèi)膜電位絕對值減少，在達(dá)到閾電位水平后同樣激活L型鈣通道，進(jìn)而推動SAN細(xì)胞在舒張期自動除極[6]。膜鐘和鈣鐘相互影響，并受到諸多因素調(diào)控[1,7]。CaMKⅡ是調(diào)節(jié)SAN細(xì)胞起搏活動的重要信號分子。CaMKⅡ過影響下列離子通道和相關(guān)蛋白分子而調(diào)節(jié)SAN起搏功能。

2.1 CaMKⅡ調(diào)控Ca2+活動

CaMKⅡ能夠作用于多個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控靶點(diǎn)，包括細(xì)胞膜Ca2+通道和SR鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白。Terrar等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ在心房肌和SAN中的效應(yīng)部位主要位于SR，CaMKⅡ通過增強(qiáng)SR鈣釋放而激活腺苷酸環(huán)化酶間接影響心房Ca2+通道。受磷蛋白(PLB)和蘭尼堿受體2(RyR2)未受到CaMKⅡ磷酸化時(shí)能夠負(fù)性調(diào)節(jié)SR的Ca2+-ATP酶2a，經(jīng)CaMKⅡ催化磷酸化后其負(fù)性調(diào)節(jié)作用消除[3]。PLB磷酸化后，SR經(jīng)SR的Ca2+-ATP酶2a從胞漿中攝取的Ca2+增加；RyR2上包括絲氨酸2814在內(nèi)的幾個(gè)磷酸化位點(diǎn)磷酸化后，SR經(jīng)RyR2釋放的Ca2+增加[3]。因此，CaMKⅡ能夠促進(jìn)Ca2+從胞漿中進(jìn)入SR，再經(jīng)RyR2釋放Ca2+促進(jìn)局部鈣釋放，最后加快鈉鈣交換體的鈉鈣交換速度，最終使SAN動作電位頻率增加，應(yīng)激時(shí)小鼠的心率反應(yīng)速度加快[3]。

CaMKⅡ能夠調(diào)控鈣火花，該過程獨(dú)立于蛋白激酶A(PKA)對PLB的磷酸化調(diào)節(jié)作用，但前提是異丙腎上腺素(ISO)濃度要達(dá)到一定閥值，否則SAN的心率加快仍然主要受PKA影響[9]，即交感神經(jīng)活性必須足夠強(qiáng)并達(dá)到一定閾值，并受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及其生物學(xué)活動過程影響，當(dāng)交感神經(jīng)活動不顯著時(shí)，CaMKⅡ調(diào)控SAN起搏功能的重要性不大。

2.2 CaMKⅡ調(diào)控If

2.3 CaMKⅡ調(diào)控鉀電流

在AC3-I小鼠心室肌細(xì)胞中，抑制CaMKⅡ能夠通過PLB上調(diào)心室肌細(xì)胞中的Ito和Ik1，縮短動作電位時(shí)程，同時(shí)伴有PKA上調(diào)導(dǎo)致的ICa上調(diào)，但急性阻斷CaMKⅡ時(shí)卻無該作用。這些現(xiàn)象表明，小鼠心室肌細(xì)胞動作電位時(shí)程縮短是CaMKⅡ長期受到抑制的一種適應(yīng)性表型轉(zhuǎn)變[14]，尚未有研究報(bào)道CaMKⅡ是否能夠調(diào)節(jié)SAN的Ito和Ik1。

2.4 CaMKⅡ調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的心率

Wu等[9]發(fā)現(xiàn)ISO刺激或者應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，約50%的心率加快反應(yīng)需要CaMKⅡ參與。CaMKⅡ抑制劑KN-93能以劑量依賴方式抑制SAN自發(fā)性動作電位的頻率和幅度，局部的鈣瞬變能通過調(diào)節(jié)CaMKⅡ活性影響ICa-L的失活和復(fù)活，CaMKⅡ活性對基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)的SAN動作電位形成意義重大[18]。當(dāng)用大劑量ISO刺激含CaMKⅡ抑制性肽段的AC3-I小鼠的SAN細(xì)胞時(shí)，該SAN細(xì)胞的最大舒張電位維持不變，細(xì)胞中SR的鈣火花時(shí)程和程度、鈣瞬變增加最大速率未見明顯改變，但SAN細(xì)胞SR自發(fā)性舒張期鈣釋放頻率和鈣攝取減慢，SR鈣含量降低，舒張期去極化速率和動作電位頻率也繼而降低，產(chǎn)生心率降低效應(yīng)[9]。另一CaMKⅡδ基因敲除小鼠的研究也證實(shí)了SR的鈣含量降低、鈣火花減少現(xiàn)象[19]，此過程受到胞內(nèi)鈣濃度和鈣瞬變的精密調(diào)控，AC3-I小鼠SAN細(xì)胞SR中的鈣存儲、鈣釋放和鈣攝取都受到了抑制，從而減慢心率反應(yīng)。

總之，SAN在調(diào)控其應(yīng)激反應(yīng)過程中需要CaMKⅡ的存在，CaMKⅡ主要通過鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)影響應(yīng)激狀態(tài)時(shí)的心率。

3 CaMKⅡ調(diào)節(jié)SAN的能量代謝的機(jī)制

CaMKⅡ不僅能夠調(diào)節(jié)SAN的自律性，還能影響SAN的能量代謝過程。當(dāng)CAMKⅡ受到特異性藥物抑制時(shí)，SAN細(xì)胞內(nèi)的Ca2+循環(huán)周期動力學(xué)減慢，自發(fā)性動作電位發(fā)生速率降低，且cAMP、氧耗和黃素蛋白均減少[20]，這些都會影響SAN細(xì)胞的能量代謝。Lakatta發(fā)現(xiàn)了SAN細(xì)胞在高ATP需求下動作電位發(fā)生時(shí)的ATP供給機(jī)制：當(dāng)線粒體內(nèi)鈣濃度升高時(shí)，Ca2+激活的cAMP-PKA-CaMKⅡ信號途徑將參與調(diào)節(jié)動作電位，此時(shí)ATP需求增加。若細(xì)胞內(nèi)ATP低于基線水平，cAMP-PKA-CaMKⅡ-線粒體信號途徑將提高ATP產(chǎn)量以增加能量供應(yīng)。在此過程中，Ca2+和cAMP濃度增加，并伴有氧耗增加，但ATP黃素蛋白仍保持不變[21]。因此，CaMKⅡ能通過調(diào)節(jié)SAN細(xì)胞的離子電流影響起搏活動時(shí)同步調(diào)節(jié)SAN細(xì)胞的能量代謝過程，以保證和匹配其完成SAN自律性活動的調(diào)節(jié)功能。

然而，SAN高自律性所伴隨的高能量耗費(fèi)方式若長期存在，則有可能對SAN有潛在的損害作用。譬如，在高代謝狀態(tài)下，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)激活的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶[22]或糖尿病小鼠血液中的高血糖誘導(dǎo)線粒體生成過多的活性氧(ROS)[23]均能將CaMKⅡ氧化為ox-CaMKⅡ，誘導(dǎo)SAN細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致SAN功能障礙。

4 ROS通過CaMKⅡ誘導(dǎo)SAN功能障礙

CaMKⅡ可被ROS激活[24]，CaMKⅡ活性過強(qiáng)會引起鈣超載，誘導(dǎo)ROS生成增加，并最終導(dǎo)致SAN細(xì)胞損傷或者死亡[22-23]。SAN功能障礙患者和犬心房中的ox-CaMKⅡ水平均上升。給予野生型小鼠輸注AngⅡ 3周后，小鼠SAN中ox-CaMKⅡ水平增加，并促進(jìn)SAN細(xì)胞凋亡、SAN和心房組織纖維化、心房沖動傳導(dǎo)速率減慢，并最終導(dǎo)致SAN功能障礙，這一過程可被敲除NADPH氧化激酶或抑制CaMKⅡ功能而阻斷[22-23]。AngⅡ觸發(fā)的SAN功能障礙過程能被CaMKⅡ抑制性肽段AC3I阻斷[25]。CaMKⅡ抑制性肽段CaMKⅡN只存在于神經(jīng)元而不表達(dá)于心臟[26]，心臟異位性轉(zhuǎn)基因表達(dá)CaMKⅡN也能抑制SAN功能障礙[27]。此外，AngⅡ誘導(dǎo)SAN的ox-CaMKⅡ表達(dá)需要率先激活NADPH氧化酶，缺乏該酶的p47-/-小鼠則未表現(xiàn)出顯著的SAN功能障礙[28]。

人SAN中的ox-CaMKⅡ表達(dá)在心房顫動心房中高于非心房顫動心房，而給小鼠進(jìn)行AngⅡ灌注會誘導(dǎo)增加心房顫動[29]，從側(cè)面解釋了心房顫動易致SAN功能障礙的生物學(xué)機(jī)制。轉(zhuǎn)基因表達(dá)AC3-I或基因敲入CaMKⅡδ突變片段MM-VV會阻斷氧化激活過程，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)甲硫氨酸亞砜還原酶A(能夠逆轉(zhuǎn)甲硫氨酸第一步氧化狀態(tài))的小鼠對AngⅡ誘導(dǎo)的心房顫動也表現(xiàn)出耐受現(xiàn)象[3]。這些研究表明ox-CaMKⅡ可以作為SAN功能障礙和心房顫動同時(shí)存在的信號。

因此，ox-CaMKⅡ或可視為SAN功能障礙的生物標(biāo)志物，CaMKⅡ抑制劑可能為SAN功能障礙高?；颊叩臐撛谥委熕幬铩?/p>

5 高血糖通過CaMKⅡ誘導(dǎo)SAN功能障礙

1992年有人報(bào)道，糖尿病是SAN疾病的危險(xiǎn)因素[30]。后來的研究證實(shí)糖尿病患者心肌梗死后的右心房中含有比正常人更高的ox-CaMKⅡ[23]，提示CaMKⅡ在高血糖致SAN疾病中起著重要作用。在高血糖狀態(tài)下，糖尿病小鼠的線粒體會生成過多的ROS，后者可將CaMKⅡ氧化為ox-CaMKⅡ，從而誘導(dǎo)SAN細(xì)胞凋亡，使SAN纖維化，并降低SAN功能及減慢其與心房肌間的傳導(dǎo)，導(dǎo)致心率減慢、心排血量減少，最終促成心肌梗死后患糖尿病小鼠的高死亡率，阻斷CaMKⅡ可降低這些小鼠的死亡率[23]；AC3-I對死亡率升高的糖尿病心肌梗死小鼠的SAN具有保護(hù)作用，意味著鏈脲佐菌素處理后的糖尿病小鼠的過多ox-CaMKⅡ是過高死亡率的必要條件[25]。鏈脲佐菌素處理小鼠在心肌梗死后死亡緣于嚴(yán)重的心動過緩，這與另一糖尿病動物模型研究觀察到心臟起搏功能缺陷的現(xiàn)象相一致[31]。

因此，CaMKⅡ及其氧化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)SAN功能障礙，導(dǎo)致心律失常。由此可見，高血糖激活的線粒體ox-CaMKⅡ信號途徑將使合并有糖尿病的心肌梗死患者早死率增加，抑制CaMKⅡ功能及其ox-CaMKⅡ水平能夠有效遏制心肌梗死后SAN功能障礙和死亡等不良結(jié)局。

6 研究展望

綜上所述，CaMKⅡ可以通過調(diào)節(jié)SAN細(xì)胞的動作電位，以Ca2+依賴方式增強(qiáng)SAN細(xì)胞的IKs，調(diào)節(jié)SAN細(xì)胞的生物能量動力學(xué)過程，參與SAN的起搏功能活動；鑒于SAN起搏過程中有諸多離子通道和生物大分子參與，膜鐘和鈣鐘相互影響，機(jī)制復(fù)雜，CaMKⅡ是否能夠通過其他機(jī)制，如調(diào)節(jié)Ik1、Ito和If調(diào)控SAN起搏，仍需進(jìn)一步的深入研究。糖尿病或AngⅡ激活并氧化為ox-CaMKⅡ，對促進(jìn)SAN功能障礙具有危害性作用。因此，進(jìn)一步闡明CaMKⅡ在SAN功能中的作用及機(jī)制，可以為CaMKⅡ作為潛在治療心律失常的藥物靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)；如在高血糖或者高應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，CaMKⅡ抑制劑對SAN功能障礙具有潛在的治療作用。

[1] Monfredi O,Maltsev VA,Lakatta EG.Modern concepts concerning the origin of the heartbeat[J].Physiology (Bethesda),2013,28(2):74-92.

[2] Maltsev VA,Vinogradova TM,Lakatta EG.The emergence of a general theory of the initiation and strength of the heartbeat[J].J Pharmacol Sci,2006,100(5):338-369.

[3] Wu Y,Anderson ME.CaMKⅡ in sinoatrial node physiology and dysfunction[J].Front Pharmacol,2014,5:48.

[4] Anderson ME.Calmodulin kinase signaling in heart:an intriguing candidate target for therapy of myocardial dysfunction and arrhythmias[J].Pharmacol Ther,2005,106(1):39-55.

[5] Joung B,Chen PS,Lin SF.The role of the calcium and the voltage clocks in sinoatrial node dysfunction[J].Yonsei Med J,2011,52(2):211-219.

[6] DiFrancesco D.The role of the funny current in pacemaker activity[J].Circ Res,2010,106(3):434-446.

[7] Lakatta EG,Maltsev VA,Vinogradova TM.A coupled system of intracellular Ca2+clocks and surface membrane voltage clocks controls the timekeeping mechanism of the heart’s pacemaker[J].Circ Res,2010,106(4):659-673.

[8] Terrar DA,Collins TP.Ca(2+)-stimulated adenylyl cyclases regulate the l-type Ca(2+) current in guinea-pig atrial myocytes[J].J Physiol,2012,590(8):1881-1893.

[9] Wu YJ,Gao Z,Chen BY,et al.Calmodulin kinaseⅡis required for fight or flight sinoatrial node physiology[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(14):5972-5977.

[10] Klockner U,Isenberg G.Calmodulin antagonists depress calcium and potassium currents in ventricular and vascular myocytes[J].Am J Physiol,1987,253(6 Pt 2):H1601-1611.

[11] Rigg L,Mattick PAD,Heath BM,et al.Modulation of the hyperpolarization-activated current (I(f)) by calcium and calmodulin in the guinea-pig sino-atrial node[J].Cardiovasc Res,2003,57(2):497-504.

[12] Chatelier A,Renaudon B,Bescond J,et al.Calmodulin antagonist W7 directly inhibits f-type current in rabbit sino-atrial cells[J].Eur J Pharmacol,2005,521(1-3):29-33.

[13] Liao ZD,St Clair JR,Larson ED,et al.Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes[J].Channels,2011,5(2):115-119.

[14] Li J,Marionneau C,Zhang R,et al.Calmodulin kinaseⅡinhibition shortens action potential duration by upregulation of K+currents[J].Circ Res,2006,99(10):1092-1099.

[15] Matsuura H,Xie Y,Ding WG.Ca2+/calmodulin potentiates Iks in sinoatrial node cells by activating Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ[J].Pflugers Arch,2015,467(2):241-251.

[16] DiFrancesco D,Tortora P.Direct activation of cardiac pacemaker channels by intracellular cyclic AMP[J].Nature,1991,351(6322):145-147.

[17] Joung B,Tang L,Maruyama M,et al.Intracellular calcium dynamics and acceleration of sinus rhythm by beta-adrenergic stimulation[J].Circulation,2009,119(6):788-796.

[18] Vinogradova TM,Zhou YY,Bogdanov KY,et al.Sinoatrial node pacemaker activity requires Ca(2+)/calmodulin-dependent protein kinaseⅡactivation[J].Circ Res,2000,87(9):760-767.

[19] Xu L,Lai D,Cheng J,et al.Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKⅡ{delta} knockout mice[J].Circ Res,2010,107(3):398-407.

[20] Yaniv Y,Spurgeon HA,Ziman BD,et al.Ca(2)+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ(CaMKⅡ) activity and sinoatrial nodal pacemaker cell energetics[J].PLoS One,2013,8(2):e57079.

[21] Yaniv Y,Spurgeon HA,Ziman BD,et al.Mechanisms that match ATP supply to demand in cardiac pacemaker cells during high ATP demand[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2013,304(11):H1428-H1438.

[22] Swaminathan PD,Purohit A,Soni S,et al.Oxidized CaMKⅡcauses cardiac sinus node dysfunction in mice[J].J Clin Invest,2011,121(8):3277-3288.

[23] Luo M,Guan X,Luczak ED,et al.Diabetes increases mortality after myocardial infarction by oxidizing CaMKⅡ[J].J Clin Invest,2013,123(3):1262-1274.

[24] Erickson JR,Joiner ML,Guan X,et al.A dynamic pathway for calcium-independent activation of CaMKⅡby methionine oxidation[J].Cell,2008,133(3):462-474.

[25] Zhang R,Khoo MS,Wu Y,et al.Calmodulin kinaseⅡinhibition protects against structural heart disease[J].Nat Med,2005,11(4):409-417.

[26] Chang BH,Mukherji S,Soderling TR.Characterization of a calmodulin kinaseⅡinhibitor protein in brain[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(18):10890-10895.

[27] Kikuchi K,McDonald AD,Sasano T,et al.Targeted modification of atrial electrophysiology by homogeneous transmural atrial gene transfer[J].Circulation,2005,111(3):264-270.

[28] Huang CK,Zhan L,Hannigan MO,et al.P47(phox)-deficient NADPH oxidase defect in neutrophils of diabetic mouse strains,C57BL/6J-M db/db and db/+[J].J Leukoc Biol,2000,67(2):210-215.

[29] Purohit A,Rokita AG,Guan XQ,et al.Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ triggers atrial fibrillation[J].Circulation,2013,128(16):1748-1757.

[30] Podlaha R,Falk A.The prevalence of diabetes mellitus and other risk factors of atherosclerosis in bradycardia requiring pacemaker treatment[J].Horm Metab Res Suppl,1992,26:84-87.

[31] Howarth FC,Al-Sharhan R,Al-Hammadi A,et al.Effects of streptozotocin-induced diabetes on action potentials in the sinoatrial node compared with other regions of the rat heart[J].Mol Cell Biochem,2007,300(1-2):39-46.