環(huán)狀RNA與心血管疾病

李少川，李菊香

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

1 環(huán)形RNA(circular RNA,circRNA)概述

CircRNA首次在RNA病毒中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在酵母菌和真核生物中也證實(shí)其存在，小鼠的性別決定區(qū)SRY中也發(fā)現(xiàn)了circRNA。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，尤其是RNA-seq技術(shù)的開(kāi)發(fā)[2]，circRNA的研究在幾年得到快速發(fā)展。circRNA的主要特征是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，外顯子的3′端轉(zhuǎn)回并連接其上游外顯子的5′端以形成閉合分子。與經(jīng)典的線性RNA不同，circRNA不存在5′帽和3′多聚腺苷酸尾。由于不存在游離末端，所以這些分子不容易水解，特殊的環(huán)形結(jié)構(gòu)使circRNA具有一定的保守性和穩(wěn)定性[3]。對(duì)脫支酶和RNA外切核酸酶具有較高的抵抗，也因?yàn)橐恍┩怙@子環(huán)RNA的基因產(chǎn)物水平高于線性RNA， 所以circRNA可以作為生物標(biāo)志物來(lái)診斷疾病，也可以作為預(yù)后評(píng)估的一個(gè)指標(biāo)，還可以在治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。由于circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以特異性地結(jié)合miRNA并抑制其功能，這一機(jī)制稱為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA(ceRNA)機(jī)制，類似海綿吸收miRNA，稱之為miRNA海綿體作用(miRNA sponge)。許多疾病與circRNA相關(guān)，如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管和自身免疫性等疾病都被證明與circRNA密切相關(guān)。circRNA通過(guò)與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA作用在分子水平對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)，提示circRNA可以成為一種新的基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑。

1.1 circRNA與心肌肥厚

目前有多種機(jī)制解釋心肌肥大如何進(jìn)展成心力衰竭，如通過(guò)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸/NFAT途徑和血管緊張素系統(tǒng)等發(fā)揮作用，但尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的機(jī)制詮釋心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。有報(bào)道指出從circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)篩選了100個(gè)circRNA，其中 36個(gè)circRNA在心臟高度表達(dá)，稱為心臟相關(guān)的circRNA(HRCR)。并發(fā)現(xiàn)HRCR可以通過(guò)與miRNA結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能[4]。miR- 223通過(guò)抑制其下游靶點(diǎn)ARC(具有CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡阻抑物，ARC的3′UTR是miR- 223的結(jié)合位點(diǎn))，使其表達(dá)降低。miR- 223使ARC在心肌細(xì)胞中表達(dá)降低，可以增強(qiáng)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的心肌肥厚作用。HRCR可以作為miR- 223海綿狀物結(jié)合并抑制miR- 223的活性，因此認(rèn)為 HRCR是抗增殖因子，抑制心肌的肥大，初步的結(jié)果證明circRNA在心肌肥大誘發(fā)的心力衰竭中起關(guān)鍵作用。雖然證明miR223可以由 HRCR調(diào)節(jié)，但是不排除其他circRNA或其他基因及表達(dá)產(chǎn)物可直接或間接地調(diào)節(jié)miR- 223。在ISO心力衰竭模型中的其他HRCR非依賴性途徑和它們?cè)谡{(diào)節(jié)miR- 223中的作用尚需進(jìn)一步確定， miR- 223的下游靶點(diǎn)需更深入的研究。

1.2 circRNA與心肌細(xì)胞衰老

心肌細(xì)胞衰老是身體功能的逐漸惡化和死亡的主要原因，可發(fā)生在細(xì)胞水平或生物水平。細(xì)胞衰老，也稱為復(fù)制衰老，其特征在于二倍體細(xì)胞的有絲分裂停止，而生物水平衰老的特征在于應(yīng)激反應(yīng)降低和穩(wěn)態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致生物體的正常功能喪失。在生物應(yīng)激中，常用化學(xué)藥物多柔比星(Dox)來(lái)產(chǎn)生氧化應(yīng)激以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，制作心肌功能不全模型[5]。circRNA Foxo3的異位表達(dá)促進(jìn)Dox誘導(dǎo)心肌病形成，但沉默內(nèi)源性circRNA Foxo3可以減緩Dox的作用并阻止心肌病的形成。細(xì)胞質(zhì)中異位表達(dá)的circRNA Foxo3結(jié)合抗衰老相關(guān)蛋白ID1和E2F1、抗應(yīng)激相關(guān)蛋白HIF1α和FAK(HIF1α和FAK均可以抑制衰老)。細(xì)胞質(zhì)中Foxo3的增加導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中ID1、E2F1、HIF1α和FAK的含量減少。這些蛋白質(zhì)的抗衰老功能被阻斷，其結(jié)果是，circRNA Foxo3的異位表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞衰老，而沉默circRNA-Foxo3減少細(xì)胞衰老和凋亡。有報(bào)道靈芝可以抑制CIRC-Foxo3并且提高左室射血分?jǐn)?shù),改善心輸出量，改善心肌衰老[6]。

1.3 circRNA與心肌細(xì)胞纖維化

心肌纖維化受多種因素調(diào)節(jié)，其中基因水平的影響不容忽視。有報(bào)道在小鼠心肌纖維化模型中circRNA的表達(dá)譜和潛在機(jī)制[7]。使用circRNA微陣列檢查糖尿病小鼠心肌的circRNA發(fā)現(xiàn)43個(gè)circRNA異常表達(dá)，包括24個(gè)上調(diào)和19個(gè)下調(diào)。在血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)處理的糖尿病小鼠心肌中的心臟成纖維細(xì)胞(CFs)中，circRNA_010567顯著上調(diào)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)circRNA_010567可以作為miR- 141的海綿體，而且miR- 141可以直接靶向TGF-β1并抑制其表達(dá)(雙熒光素酶測(cè)定驗(yàn)證)。隨后實(shí)驗(yàn)顯示circRNA_010567沉默可上調(diào)miR- 141并下調(diào)TGF-β1(纖維化的必需分子)表達(dá)。同時(shí)可以抑制Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA等成纖維細(xì)胞的表達(dá)。circRNA_010567 / miR- 141 / TGF-β1在糖尿病小鼠心肌纖維化模型中起著重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)有類似研究發(fā)現(xiàn)circRNA_000203可以通過(guò)消除miR- 26b- 5p與Col1a2和CTGF的靶標(biāo)相互作用來(lái)抑制miR- 26b的抗纖維作用[8]。這個(gè)過(guò)程也是利用了circRNA的miRNA的海綿作用與miR- 26b- 5p緊密結(jié)合。circRNA_000203特異性增強(qiáng)Col1a2、Col3a1和α-SMA等成纖維細(xì)胞的表達(dá)，miR- 26b就是通過(guò)抑制Col1a2、Col3a1、α-SMA和CTGF在內(nèi)的纖維化相關(guān)基因的表達(dá)而起到抗纖維化的作用。所以circRNA_000203的表達(dá)增多會(huì)引起心肌纖維化。circRNA_010567和circRNA_000203分別作為miR- 141和miR- 26b- 5p的海綿體起到抑制miRNA的作用。上述研究發(fā)現(xiàn)心肌纖維化的過(guò)程中兩類RNA相互作用至關(guān)重要。miRNA可以抑制纖維化，而circRNA可以抵消miRNA的抗纖維化作用，從基因水平闡述了心肌纖維化的調(diào)控作用。

1.4 circANRIL動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種全身性疾病，是由于脂肪沉積物、炎性反應(yīng)、細(xì)胞和瘢痕組織在動(dòng)脈壁內(nèi)積累而導(dǎo)致的疾病。 有報(bào)道circ ANRIL參與AS發(fā)生[9]，circANRIL是在染色體9p21的AS基因座上轉(zhuǎn)錄的INK4基因座。circANRIL中的環(huán)狀反義非編碼RNA通過(guò)控制核糖體RNA(rRNA)成熟來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化形成。實(shí)驗(yàn)證實(shí)circANRIL結(jié)合到rRNA的C端賴氨酸豐富的區(qū)域PES1上，占據(jù)PES1與pre-rRNA結(jié)合位點(diǎn)，阻止核酸外切酶介導(dǎo)的rRNA成熟。circANRIL抑制核糖體形成過(guò)程并導(dǎo)致pre-rRNA的積累，導(dǎo)致p53活化和隨后細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致增殖率的降低，通過(guò)減少過(guò)度增殖的平滑肌細(xì)胞使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生減少。提示circANRIL可以作為治療AS的潛在治療靶標(biāo)。

1.5 circRNA與冠心病

冠心病(coronary atherosclerotic heart disease， CAD)是心血管疾病中致死率最高的疾病[10]，一直被臨床工作者重視，但早期診斷存在一定的困難。目前診斷的方式有很多種，無(wú)創(chuàng)檢查有心電圖(ECG)、心電圖平板運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)(TET)、動(dòng)態(tài)心電圖(Holter)監(jiān)測(cè)和冠狀動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層攝影(CTA)，有創(chuàng)冠狀動(dòng)脈造影(CAG)檢查。但是各自存在弊端，ECG靈敏度以及特異性低，CTA價(jià)格昂貴，患者一般難以接受CAG檢查。hsa_circ_0124644在冠狀動(dòng)脈疾病的患者中明顯上調(diào)，靈敏度和特異性分別為0.861和0.626，hsa_circ_0098964敏感性和特異性分別為0.825和0.730[11]。常規(guī)ECG的靈敏度和特異性已顯示為0.290和0.670[12]。Holter及TET監(jiān)測(cè)的靈敏度和特異性分別為0.649、0.894[13]和0.731、0.693[14]，CTA的靈敏度和特異性分別為0.920和0.750[15]，CAG一直作為CAD的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。綜合價(jià)格和患者的依從性等因素，hsa_circ_0124644和hsa_circ_0098964可以作為診斷CAD的一種手段。而且circ RNA的特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)不易被酶分解，更加證明了其可以作為診斷CAD的一種方法。

1.6 circRNA與心肌梗死

心肌梗死(myocardial infarction,MI)一般發(fā)生于冠心病的基礎(chǔ)上，心肌梗死多伴有心肌細(xì)胞的凋亡。有報(bào)道用左前動(dòng)脈永久結(jié)扎制造大鼠心力衰竭模型發(fā)現(xiàn)circRNA Cdr1as和miR- 7a的共表達(dá)，且Cdr1as是miR- 7a的海綿體，可以抑制miR- 7a的生物學(xué)功能[16]。miR- 7a通過(guò)靶向抑制PARP和SP1的表達(dá)(PARP和SP1均是可以促進(jìn)心肌凋亡的蛋白)，從而抑制MI的心肌凋亡。circRNA Cdr1as可以引發(fā)MI，其中一條途徑就是通過(guò)抑制miR- 7a對(duì)PARP和SP1的抑制作用。還發(fā)現(xiàn)miR- 7a并不受過(guò)表達(dá)的Cdr1as所誘導(dǎo)， miR- 7a對(duì)正常的心肌細(xì)胞凋亡無(wú)影響，僅僅對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌凋亡有影響，并且在應(yīng)激狀態(tài)下才會(huì)被Cdr1as所抑制。有報(bào)道在冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡大鼠模型中發(fā)現(xiàn)mm9-circ 01659 明顯上調(diào)，稱之為MFACR(線粒體裂變和凋亡相關(guān)的circRNA)，通過(guò)海綿體作用下調(diào)miR- 652- 3p控制心臟線粒體分裂和細(xì)胞凋亡[17]。miR- 652- 3p可以通過(guò)抑制MTP18(線粒體蛋白18)的表達(dá)來(lái)阻斷線粒體裂隙和心肌細(xì)胞死亡。MFACR在細(xì)胞質(zhì)中直接螯合miR- 652- 3p并抑制其活性。 實(shí)驗(yàn)證明敲低MFACR的小鼠心肌細(xì)胞線粒體裂解的現(xiàn)象減弱,表明circRNA在調(diào)節(jié)心臟線粒體動(dòng)力學(xué)和凋亡中的關(guān)鍵作用。MFACR和circRNA Cdr1as的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究MI的發(fā)生以及后續(xù)的診斷和治療提供了新的依據(jù)。

1.7 circRNA與主動(dòng)脈瘤

主動(dòng)脈瘤是指主動(dòng)脈病理性的擴(kuò)張，超過(guò)正常血管直徑的50%，具有很高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)hsa-circ- 000595與主動(dòng)脈平滑肌凋亡有關(guān)，進(jìn)而影響主動(dòng)脈瘤的發(fā)生。在低氧條件下主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中hsa-circ- 000595的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)敲低hsa-circ- 000595發(fā)現(xiàn)低氧條件下主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡減弱。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)hsa-circ- 000595是作為miR- 19a海綿體來(lái)起作用的，hsa-circ- 000595減低可以使miR- 19a表達(dá)增加，從而減少平滑肌細(xì)胞凋亡[18]。miR- 19a影響平滑肌細(xì)胞的機(jī)制還需要進(jìn)一步探討，但是hsa-circ- 000595的發(fā)現(xiàn)可以為診治主動(dòng)脈瘤提供一個(gè)新的基因?qū)W上的依據(jù)。

2 小結(jié)

隨著基因測(cè)序技術(shù)的升級(jí)，越來(lái)越多的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)被建立，有許多在線數(shù)據(jù)庫(kù)可以用于circRNA的研究，目前僅有少數(shù)circRNA被證明與心血管疾病有關(guān)，如HRCR、hsa_circ_0124644和circRNA Cdr1as等，其中大部分circRNA都是作為miRNA的海綿體而發(fā)揮作用，提示兩者之間可能存在著某種聯(lián)系，但作為與遺傳高度相關(guān)的高血壓和心律失常等疾病卻無(wú)circRNA的身影，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類體內(nèi)含有上萬(wàn)個(gè)circRNA，其中是否有大量和心臟疾病相關(guān)的circRNA值得研究。