中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制中作用的研究進展

林笑穎，周明倩，李海昌

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種經(jīng)典的自身免疫性疾病，以大量自身抗體形成為主要特征，并導(dǎo)致全身多臟器及系統(tǒng)受累。SLE病因和發(fā)病機制尚不明確，最新研究[1]顯示：中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)的形成過多及清除障礙可能參與SLE的發(fā)病機制，SLE患者體內(nèi)的NETs水平與SLE活動度評分(SLE disease activity index,SLEDAI)呈正相關(guān)關(guān)系。

NETs自2004年被提出以來，已成為機體重要的防御方式，同時也是系統(tǒng)性自身免疫病發(fā)病機制中的主要參與者[2]。NETs以解聚的染色質(zhì)作為骨架，上面鑲嵌著核組蛋白、多種顆粒蛋白和某些胞漿蛋白，其中顆粒蛋白組分包括一級顆粒如彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和二級顆粒中的乳鐵蛋白酶、抗菌肽 LL-37 及來源于三級顆粒的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、肽聚糖識別蛋白等[3]。NETs所含的內(nèi)容物及其與SLE之間的關(guān)系越來越受到關(guān)注。

1 NETs的形成

NETs形成作為新形式的細胞死亡過程被稱為NETosis。形態(tài)學(xué)上，網(wǎng)捕死亡(NETosis)從核小葉消失開始，其次是染色質(zhì)解鏈和核包膜分解成含有解鏈染色質(zhì)的小囊泡，隨后核囊泡和胞質(zhì)顆粒的膜崩解，導(dǎo)致染色質(zhì)與細胞質(zhì)和顆粒內(nèi)容物混合，最后質(zhì)膜破裂，抗微生物顆粒蛋白質(zhì)裝飾的細胞質(zhì)釋放到細胞外空間如NETs中[4]。

NETs形成的機制和NETosis的亞細胞單位尚未完全被闡明，但NETosis的特征在于核膜分解，使染色質(zhì)解鏈和基因組DNA暴露于活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS在嗜中性粒細胞的活化及其細胞內(nèi)容物的釋放過程中起到調(diào)節(jié)作用。除煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)在吞噬體膜上的呼吸爆發(fā)途徑產(chǎn)生ROS外，線粒體也是ROS生成的主要部位之一[5]，ROS的產(chǎn)生是NETs形成的早期關(guān)鍵步驟。此外，染色質(zhì)解聚需要組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾轉(zhuǎn)化成為瓜氨酸化組蛋白(citrullinated histone，citH)，這一過程依賴于肽酰基精氨酸脫亞氨酶(peptidylarginine deiminase，PAD)的催化[6]。PAD是5種鈣依賴性酶的家族，其催化各種靶蛋白的瓜氨酸化過程，其中參與NETs形成的是PAD4。

2 NETs與SLE的直接關(guān)系

2.1 NETs是自身抗原的來源之一 NETs作為自身抗原可以誘導(dǎo)抗NET抗體的產(chǎn)生，如NETs形成過程中釋放的DNA、顆粒蛋白和組蛋白等物質(zhì)，可引發(fā)或加重SLE病情。同時，SLE患者體內(nèi)由凋亡細胞等形成的循環(huán)微粒有增強NETosis作用[7]，其中在SLE患者體內(nèi)異常升高的循環(huán)游離DNA(cfDNA)濃度與活動性狼瘡腎炎有關(guān)[8]。Darrah 等[2]研究顯示：已鑒定的NETs蛋白質(zhì)中有84%為自身免疫病、癌癥或兩者共有的自身抗原，74% 蛋白質(zhì)是自身免疫性疾病自身抗體的靶點。SLE患者外周血中死亡傾向的中性粒細胞數(shù)增加并伴隨雙鏈DNA抗體水平的增加，且與SLE的嚴重程度呈正相關(guān)關(guān)系，線粒體DNA(mtDNA)沉積在NETs中，SLE患者的抗mtDNA抗體水平升高，與干擾素(interferon，IFN)評分和疾病活動指數(shù)有密切關(guān)聯(lián)[9]。SLE患者血清中中性粒細胞抗菌肽LL37與雙鏈 DNA 所形成的免疫復(fù)合物(immune complexes，ICs)能作為自身抗原通過B細胞受體和Toll樣受體-9活化B細胞，產(chǎn)生抗DNA抗體和抗菌肽LL37抗體，上述抗體均能在SLE患者體內(nèi)被檢出[10]。此外，在血漿中檢測到的彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)主要來源于中性粒細胞釋放的NETs，NE能夠降解核心組織蛋白，暴露新的抗原表位，從而產(chǎn)生新的抗原，也是NETs引起自身抗體產(chǎn)生的原因之一。

在NETosis過程中有多種酶和活性氧修飾NETs內(nèi)的蛋白質(zhì)，如NE和組織蛋白酶。酪氨酸和色氨酸的氧化會改變細胞核內(nèi)自身抗原的功能，這些修飾的蛋白可能會是自身免疫細胞的靶點。此外，釋放的蛋白酶分解組蛋白氨基酸末端，暴露出自身抗原表位，產(chǎn)生自身抗體[11]。NETs中的組蛋白除了能產(chǎn)生抗組蛋白自身抗體外，Pieterse等[12]發(fā)現(xiàn)：乙酰化組蛋白和甲基化殘留物的增加能通過增強NETs中抗菌肽的結(jié)合來間接增加NETs的免疫潛能，引起自身抗體的產(chǎn)生。而且，NETs中經(jīng)修飾后的自身抗原有助于破壞易感宿主的免疫耐受性[13]。

2.2 SLE存在NETs清除缺陷 在正常條件下，單核源巨噬細胞可有效清除NETs，巨噬細胞吞噬后，NETs通過吞噬細胞穿梭到溶酶體中進行降解。由巨噬細胞攝取NETs不誘導(dǎo)促炎細胞因子分泌，因此免疫沉默[14]。

SLE患者體內(nèi)的NETs增多，其主要原因如下：①NETs生成增多，SLE患者體內(nèi)中性粒細胞增加，且有趨于NETosis的傾向；②NETs降解減少，SLE血清中存在抗NETs抗體，保護NETs免受脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribenuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)作用，患者血清對NETs降解能力減弱、抗NETs抗體的存在及低DNase Ⅰ活性導(dǎo)致NETs的積累[15]。亦有研究[16]證明：NETs降解受損也與狼瘡腎炎、低補體血癥和自身抗體水平升高有關(guān)。

此外，62%SLE患者的血清中抗DNase抗體陽性，識別DNase催化位點附近保守表位的抗體可保護NETs免受降解，且SLE患者血清中抗DNaseⅠ和抗DNA抗體水平呈正相關(guān)關(guān)系，可能參與SLE的發(fā)病機制[17]。在“非降解物”的腎活檢中，NETs上存在抗體沉積，表明ICs在腎臟內(nèi)沉積，導(dǎo)致狼瘡腎[18]。Leffler等[19]觀察到：活動性SLE患者體中血清降解NETs的能力下降。補體C1q與NETs結(jié)合，激活補體經(jīng)典途徑，成為DNase Ⅰ抑制劑使NETs降解減少。NETs降解減少和激活的補體與NETs特異性自身抗體的存在有關(guān)，并可進一步放大炎癥反應(yīng)。NETs的低效降解也參與了自身抗體的產(chǎn)生，破壞了自我耐受，引起主要針對核自身抗原的自身免疫反應(yīng)。自身抗原能誘發(fā)和增強自身抗體介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)，并且在SLE或血管炎患者中持續(xù)誘導(dǎo)局部和全身炎癥[20]。由此可知，異常數(shù)量的NETs產(chǎn)生自身抗原和自身抗體，并在SLE患者中產(chǎn)生持續(xù)損傷，直接參與SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。

3 NETs與其他免疫細胞之間的關(guān)系

3.1 NETs能激活NOD(nucleotide-binding oligomerization domain)樣受體家族3(NLRP3)炎性小體 NETs能刺激炎性小體，激活炎癥通路。NLRP3炎性小體中的中樞酶caspase-1在SLE疾病發(fā)展過程中起著重要作用，NETs和抗菌肽 LL37可通過P2X7受體途徑激活巨噬細胞中的caspase-1，產(chǎn)生大量的白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素18(IL-18)，進一步促進炎性反應(yīng)和NETosis，形成潛在的惡性炎性循環(huán)[21]；異常的炎性小體激活和IL-18的大量產(chǎn)生可損傷血管的修復(fù)功能，導(dǎo)致SLE患者出現(xiàn)心血管系統(tǒng)疾??；另外，IL-18還參與狼瘡腎炎及皮膚病變的病理過程。

3.2 低密度粒細胞(low-density granulocyte，LDG)增加NETs形成 LDG是在SLE患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種異常促炎性嗜中性粒細胞亞群，表現(xiàn)出增強的自發(fā)性NETs。LDG分泌高水平促炎因子和α-干擾素(interferon-alpha，IFN-α)，對內(nèi)皮細胞具有明顯的毒性[22]，促進SLE的血管損傷[23]。IFN-α被認為是SLE發(fā)病機制的中樞介質(zhì)，IFN-α能降低內(nèi)皮修復(fù)能力導(dǎo)致SLE患者體內(nèi)動脈粥樣硬化保護機制受損[24]。尤其在未增加刺激的情況下，狼瘡LDG被誘發(fā)持續(xù)地產(chǎn)生NETs，通過生成過多的NETs，LDG提高了自身抗原和免疫刺激分子的水平。

3.3 NETs殺傷內(nèi)皮細胞促進血栓形成 異常的NETs形成能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷及增強血栓形成。SLE患者體內(nèi)LDG誘導(dǎo)產(chǎn)生的NETs能夠提高MMP-9水平，激活內(nèi)皮MMP-2，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡[25]。MMPs的循環(huán)水平與動脈粥樣硬化事件的風險有關(guān)，而且高MMP-9水平與冠狀動脈疾病進展和致命的心血管事件有關(guān)。在SLE患者體內(nèi)MMP-9和抗MMP-9抗體組成的ICs能誘發(fā)NETs形成，并進一步加速血管病變。NETs中含有的高濃度血栓源性組織因子(tissue factor，TF)是靜脈和動脈血栓形成的必要條件。中性粒細胞在內(nèi)皮損傷的部位聚集，激活釋放NETs，NETs誘捕血小板和紅細胞，形成微血管血栓。

3.4 NETs促進漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)合成高水平IFN-α Garcia-Romo等[26]報道：與健康者比較，SLE患者的NETs能夠激活pDC產(chǎn)生IFN-α、干擾素γ 誘導(dǎo)蛋白10(IFN-γ inducible protein 10，IP-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)。另外，Lande 等[10]證明：抗菌肽LL37除了能產(chǎn)生自身抗體，還能夠保護DNA不被胞外物質(zhì)降解，通過Toll樣受體9(TLR9)和Toll樣受體7(TLR7)活化pDC釋放INF-α，INF-α進一步導(dǎo)致NETs形成增加，釋放更多的LL37，形成惡性循環(huán)。由此可知，NETs激活pDC需要NETs中的抗菌肽。NETs的超乙?；旧|(zhì)激活骨髓和pDC并隨后打破自我耐受，最終導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細胞和B細胞的激活，產(chǎn)生表征SLE的多種自身抗體?？梢?，SLE患者體內(nèi)的NETs與NLRP3炎性小體和INF-α等相互作用形成病理性的反饋環(huán)路，揭示了NETs成為潛在治療靶點的可能。

4 與NETs相關(guān)的SLE治療潛在方向

針對NETs形成過程中關(guān)鍵的亞細胞事件或增強NETs清除率的藥物可以為SLE及相關(guān)自身免疫性疾病提供新型治療策略。潛在的治療靶點包括以下幾點。

4.1 增強NETs清除的靶點 NETs是由DNA骨架所構(gòu)成，研究[19，27]顯示：加入外源性的DNase Ⅰ不僅能恢復(fù)SLE患者受損NETs的降解功能，同時還發(fā)揮著抗血栓作用，降解損傷隨著個體患者的疾病活動而變化。也有研究者[28]將重組DNase(rDNase)視為SLE治療的潛在靶點。

4.2 抑制NETs生成的靶點 已知線粒體ROS能增強NETosis。研究[29]顯示：使用線粒體ROS清除劑能消除LDG的NETosis以及自身免疫特征和臨床表型。Van Avondt等[30]首次描述白細胞信號抑制受體1(SIRL-1)，一種帶有ITIM的抑制性受體，通過消除MEK-ERK途徑信號傳導(dǎo)和抑制ROS形成來抑制NETs生成而成為治療靶點。動物模型和人體的初步證據(jù)[31-32]表明：抑制PAD酶和其他嗜中性粒細胞相關(guān)靶標的靶向可有效預(yù)防NETs形成、減少與SLE相關(guān)的器官損傷，而且不會對治療相關(guān)的感染性后遺癥造成重大風險。抑制磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide3-kinases，PI3Ks)和相關(guān)酶的渥曼青霉素可以阻止空泡化和細胞內(nèi)染色質(zhì)解鏈，從而防止NETs形成和促進嗜中性粒細胞凋亡[33]。此外，生理濃度的抗瘧藥物是治療SLE患者的主要藥物，可以在體外抑制NETs形成[34]。維生素D與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A可抑制NETosis，降低內(nèi)皮損傷[35-36]。

綜上所述，SLE患者體內(nèi)異常數(shù)量的NETs，不僅是自身抗原的重要來源之一，還可刺激LDG、內(nèi)皮細胞和pDC等細胞產(chǎn)生炎性因子，參與狼瘡腎炎、皮膚病變和血管損傷等過程，加重SLE病情的發(fā)展。在SLE中NETs生成增多和降解受損的機制仍有待研究。因此，以NETosis和NETs組分作為靶點控制NETs的釋放和清除有望成為臨床治療SLE的方向。