含小檗堿類中草藥總生物堿的提取工藝及其藥理研究進展*

★ 陳祥云 彭財英 盧健 陳圣加 高映 舒積成*（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 300004）

小檗堿類生物堿具有兩個異喹啉環(huán)稠合而成的母核，根據(jù)母核骨架的氧化程度，可分為季胺型和叔胺型生物堿兩種型體。在臨床上主要用于細菌性感染，常作為廣譜抗菌藥使用。另外，小檗堿類生物堿具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以及免疫抑制等多種作用［1］。在大多數(shù)小檗科植物中均含有小檗堿類生物堿，如南天竹屬、淫羊藿屬、小檗屬、十大功勞屬、八角蓮屬、山荷葉屬和桃兒七屬等屬植物，而以毛莨科黃連Coptis chinensisFranch.、蕓香科黃柏Phellodendron chinenseSchneid.、防已科黃藤Fibraurea recisa及小檗科三顆針Berberis wilsonaeHemsl.等植物最具代表。因其廣泛的藥理作用和豐富的藥用資源，對小檗堿類生物堿的關(guān)注日益增加，近年來有關(guān)其提取工藝及藥理作用研究的文獻不斷增加。為今后對此類化合物進行一步研究和開發(fā)利用，作者對近幾年含有小檗堿類中草藥總生堿的提取工藝及藥理研究進行簡要綜述。

1 提取工藝

1.1 醇提取法因游離的生物堿及其鹽均可溶于甲醇、乙醇，故可用醇回流滲漉、或浸漬法進行提取，此方法特點是對于不同存在形式的生物堿均可選用，且水溶性雜質(zhì)較少，但乙醇提取物中脂溶性雜質(zhì)較多。該方法為目前實驗室最為常用的提取方法之一。

應(yīng)用此方法對總生物堿的提取，考慮的影響因素主要有4個：醇的種類及濃度、醇體積數(shù)、提取方式及提取時間。根據(jù)文獻報道，此方法提取工藝多以乙醇為溶媒，以10～15倍量的50%～80%醇溶液為常見濃度，多采用回流提取方式，提取時間1h左右。如劉鑫［2］以鹽酸小檗堿含量為目標，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選黃連中鹽酸小檗堿的提取工藝，以遺傳算法全局優(yōu)化結(jié)果，得到的最佳工藝為：13倍藥材的50%乙醇，提取3次，每次1h。高麗紅等［3］采用紫外分光光度法測定黃柏提取物中總生物堿含量，對堿水提取法、乙醇提取法與酸水提取法的比較，得到黃柏總生物堿含量分別為0.93%、12.47%與0.34%，結(jié)果顯示，乙醇提取黃柏總生物堿的提取率最高。劉麗梅等［4］采用乙醇回流提取黃柏總生物堿，得到最佳提取工藝為：黃柏細絲2～3mm，10倍量75%乙醇回流提取3次，每次提取1.5h。趙梓辰等［5］通過正交實驗設(shè)計法，研究對黃連總生物堿提取影響的3個因素，即甲醇濃度、加醇量、超聲時間，得到的最佳提取方法為：50倍量的1%鹽酸甲醇液，其中甲醇為75%的甲醇，超聲提取1h，且認為此提取方法穩(wěn)定可行。另外，從文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象：對同一種藥材，均采用醇提方法，但不同科研人員報道出不同工藝參數(shù)。產(chǎn)生上述結(jié)果是與方法本身的重現(xiàn)性有關(guān)，還是與所選用不同藥材（產(chǎn)地、采收時間）有關(guān)？回答上述問題，更科學(xué)地應(yīng)用此類方法。

1.2 酸水提取法生物堿在植物體內(nèi)大多以鹽的形式存在，為增加生物堿的溶解度，常用0.1%～1%的硫酸、鹽酸等無機酸水提取。該方法簡單，但提取液體積較大，濃縮困難，且水溶性雜質(zhì)多，因此需進行純化富集。

涂瑤生等［6］優(yōu)選黃連總生物堿提取工藝中采用酸水提取法，以黃連總生物堿得率為指標，得到最佳提取工藝為：黃連飲片8倍量的1.5%硫酸溶液，煎煮3次，每次40min。陳陽峰［7］在黃柏提取的實驗中，考察了滲濾提取的工藝因素，得到最佳提取工藝為粉碎粒度0.1cm左右，90℃下20倍1%稀硫酸滲濾10次。郭慧琳等［8］在考察酸水提取黃連中小檗堿對致病性大腸桿菌抑菌作用的試驗中，采用正交試驗得到最佳提取工藝為：0.2%硫酸冷浸72h，15%NaCl鹽析。王道武等［9］在研究黃連中生物堿小檗堿的提取工藝中，通過對七個因素即浸泡時間，黃連顆粒粒度，稀硫酸濃度，固液比，石灰乳調(diào)節(jié)pH，HCl調(diào)節(jié)pH，NaCl用量的實驗研究中，得出稀酸鹽析法提取黃連中小檗堿的方法具有簡便，快捷，可靠等優(yōu)點。

1.3 石灰乳提取法該方法主要是利用游離生物堿緩慢溶解于水，而鹽酸小檗堿幾乎不溶于水的性質(zhì)，先加入石灰乳使小檗堿呈游離狀態(tài)溶解于水中，再轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽析出，其優(yōu)缺點與稀硫酸法相似，在實際實驗中多與其他提取方法相結(jié)合應(yīng)用［10］。如肖道安等［11］在提取分離三顆針中鹽酸小檗堿的試驗中采用石灰乳進行提取，并得到其最佳工藝，即5%石灰乳，5%食鹽，pH=2的鹽酸。

1.4 酶法植物的有效成分往往被包裹在細胞壁內(nèi)，為加快有效成分溶出，提高提取率，采用纖維素酶酶解β-D-葡萄糖鍵，破壞植物細胞壁。如，林靜等［12］在提取關(guān)黃柏總生物堿的實驗中，采用正交實驗，考察pH，溫度，浸取時間對酶解輔助關(guān)黃柏中總生物堿提取率的影響。結(jié)果顯示，0.9%纖維素酶用量，pH4.5，35℃條件下酶解2.5h，可將總生物堿提取率提高約27%。在優(yōu)化酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿的工藝中，寧娜等［13］得到最佳工藝為pH=3.5、10.6mg/g的酶量，51℃下酶解97min，且其得率為22.46mg/g。

1.5 超臨界萃取法該方法是以超臨界流體為溶劑，從固體或液體中萃取可溶組分。可以通過調(diào)節(jié)溫度和壓力進行針對性萃取，得到的生物堿量高于傳統(tǒng)技術(shù)。但投資費用高，安全要求亦高，另外高壓萃取過程中，物性數(shù)據(jù)缺乏［14］。

佟若菲等［15］采用單因素和正交實驗的方法，研究黃連中生物堿的超臨界CO2萃取工藝。結(jié)果顯示：超臨界CO2萃取黃連中生物堿的影響因素從高到低依次為萃取壓力、萃取溫度、萃取時間。且其最佳萃取工藝條件為：萃取壓力30MPa，物料粒度40～60目，60℃下萃取1.5h，此條件下黃連中生物堿萃取率為14.24%。

1.6 微波提取法微波是一種新的萃取方法，具有省時、高效和經(jīng)濟的優(yōu)點。其速度、效率以及物質(zhì)量均優(yōu)于常規(guī)工藝。在提取黃連小檗堿的試驗中，林葉新等［16］采用微波輔助回流的方法對其提取工藝進行了優(yōu)化，并得到了最佳的工藝，25倍50%的，80℃微波回流10min，提取2次。王道武等［17］采用微波輔助法提取黃連生物堿，利用高效液相毛細管電泳法進行分析，在最佳提取條件下進行定量分析，回收率從95.4%到112.7%，精密度RSD值小于7.5%，具有良好的線性關(guān)系，實驗表明該方法可以定量分析黃連中主要生物堿。

1.7 超聲提取法陳明明等［18］以鹽酸小檗堿為指標，采用離子液體輔助超聲處理黃柏總生物堿的提取工藝，并經(jīng)二項式擬合及響應(yīng)曲面分析優(yōu)化提取條件，在最優(yōu)條件下鹽酸小檗堿提取率達到5.35%，與理論預(yù)測值相對偏差小于5%。趙偉杰［19］在研究提取川黃柏中鹽酸小檗堿的新工藝中，采用超聲輔助的方式，以鹽酸小檗堿提取率為指標，得到最佳工藝即20倍HCl-70%甲醇，50℃、250W下超聲50min，并發(fā)現(xiàn)此工藝可有效提高鹽酸小檗堿的提取率。王緒英等［20］以乙醇為溶媒，采用超聲提取法提取永思小檗鹽酸小檗堿，并以單因素試驗和正交設(shè)計得到最佳超聲提取工藝，鹽酸小檗堿的平均含量達11.9633mg/g，進一步證實其可行性。趙柳英等［21］比較黃連小檗堿在乙醇回流浸提，硫酸常溫浸提及超聲輔助萃取3種方法中，發(fā)現(xiàn)超聲輔助萃取的提取率及產(chǎn)品純度均為3者最佳，由此得出超聲輔助萃取高效快捷。

1.8 解吸－內(nèi)部沸騰兩步法該方法主要有分為解吸和物料內(nèi)部沸騰兩步，先將有效成分解吸形成溶液，再通過液體沸騰產(chǎn)生的對流現(xiàn)象，達到提高提取速度的目的。趙鐘興等［22］采用解吸-內(nèi)部沸騰兩步法改進黃連中鹽酸小檗堿的提取工藝，對比最佳提取工藝與傳統(tǒng)醇提法，發(fā)現(xiàn)該法具有提取時間短、乙醇消耗少和浸膏有效成分含量高等優(yōu)點，高效經(jīng)濟。在研究提取黃柏小檗堿的試驗中，田茜等［23］對比減壓內(nèi)部沸騰法與乙醇回流法，發(fā)現(xiàn)前者的提取效率高于后者，具有簡捷高效的的優(yōu)點，并且其最佳工藝為60mL 55%乙醇，解吸30min，150mL 60℃水，減壓提取10min，提取2次。

1.9 閃式提取隨著提取方法的不斷發(fā)展及改善，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)提取方法在時間，操作量等方面存在較多問題，為提高效率，研究出了一些新的提取方法。閃式提取因其提高提取效率，經(jīng)濟節(jié)能，簡化操作等優(yōu)勢，在近年開始得到運用。王玥等［24］在研究黃柏以閃式提取的方式提取小檗堿的試驗中，得到其最佳工藝為15倍65%乙醇閃式提取2min，并發(fā)現(xiàn)該方法簡單高效經(jīng)濟。

2 藥理進展

2.1 降血糖文獻報道，小檗堿能夠促進胰島B細胞的修復(fù)，抑制糖原異生，使外周組織的葡萄糖酵解，促進胰島B細胞再生及其功能的恢復(fù)，提高抗病力等作用［25］。在研究小檗堿對Ⅱ型糖尿病大鼠的降血糖作用的試驗中，汪群紅等［26］通過對大鼠進行為期14d的給藥檢測觀察中發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠明顯改善糖尿病大鼠的癥狀，具有較好的應(yīng)用前景。

2.2 抗菌小檗堿是一個被廣泛用于治療微生物感染的異喹啉類生物堿。有關(guān)小檗堿抗菌活性的研究表明，小檗堿對不同類別微生物的抑制能力有較大差異，即小檗堿對G+菌的體外抑制作用要明顯強于對G-菌和真菌的抑制作用［27］。小檗堿能夠與細菌體內(nèi)的輔酶磷酸吡哆醛競爭酪氨酸脫羧酶、色氨酸酶上的酶蛋白，產(chǎn)生不可逆抑菌作用；抑制細菌內(nèi)糖代謝過程中的丙酮酸氧化，使細菌對維生素AT和煙酰胺等的利用受到限制從而達到抑菌效果；抑制細菌體內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和類脂的合成，干擾細菌的繁殖［28］。最近的研究表明，黃連素能增強抗生素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）臨床多重耐藥株的抑制作用。進一步表明，小檗堿能增強抗生素的殺菌活性［29］。

2.3 治療心血管疾病現(xiàn)代研究表明，小檗堿不僅有良好的抗痢作用，在心血管疾病中也具有較好的藥理作用，具有降血壓，抗心力衰竭，抗心律失常等多種藥理活性［30］。

小檗堿可競爭性阻斷α1受體，降低外周阻力從而降低血壓。同時能與膽堿酯酶活性中心結(jié)合抑制膽堿酯酶的活性，增強乙酰膽堿作用，促進NO釋放和血管內(nèi)皮合成，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管擴張達到降壓［31］。劉雪濤等［32］利用體內(nèi)、體外實驗?zāi)Ｐ?，研究單味黃連對心肌（細胞）缺血、缺氧的保護作用及機制，結(jié)果顯示黃連通過改善心?。毎┤毖⒀趸瘬p傷狀態(tài)而實現(xiàn)保護心?。毎┳饔?。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿調(diào)節(jié)心臟起搏細胞IF的能力可能有助于其抗心律失常作用。小檗堿能夠超極化激活兔心和人的竇房結(jié)自發(fā)活動，抑制環(huán)核苷酸門控通道4（hHCN4）通道電流的濃度（1～300μm）和使用依賴性，降低起搏器放電率和舒張期去極化率，并修改動作電位參數(shù)，同時減少和hHCN4通道失活動力學(xué)活化［33］，從而達到抗心律失常的作用。

2.4 調(diào)脂作用目前有研究證實小檗堿能夠改善胰島素敏感性，調(diào)節(jié)脂代謝［34］。小檗堿機制與他汀類，貝特類不同，可通過上調(diào)低密度脂蛋白受體表達，改善胰島素，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等多種方式，達到降脂的效果，且副作用?。?5-36］。在近年研究中，發(fā)現(xiàn)小檗堿及其配伍的調(diào)脂作用要強于單一的小檗堿作用［37］。

孟湧生［38］通過不同劑量黃連素對2型糖尿病大鼠血糖血脂影響的研究，顯示黃連素具有明顯的降血糖作用，同時對糖尿病伴隨的血脂增高也有一定的降脂作用，且不同劑量黃連素降脂效果有差異。通過對60例2型糖尿病并血脂異?；颊吲R床觀察，進一步確定黃連素具有降脂效果，但總體降脂效果弱于辛伐他汀。

2.5 治療消化系統(tǒng)疾病蔣紅艷等［39］研究發(fā)現(xiàn)小檗堿在消化道疾病的治療方面有較大的作用，主要治療消化性淸癌、胃炎、腸炎、腹瀉及慢性膽囊炎等。其機制與抗幽門螺桿菌作用、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣水平、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)功能等有關(guān)。劉丹［40］通過對小檗堿緩解伊立對腸道免疫系統(tǒng)損傷機制的研究，發(fā)現(xiàn)小檗堿不但能夠減少腸道損傷，緩解腹瀉，還能阻斷腸道免疫抑制微環(huán)境的形成，增強機體的抗腫瘤活性，減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機率。

2.6 免疫系統(tǒng)疾病小檗堿具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用，具有潛在的調(diào)節(jié)非特異性免疫的藥理活性。周霞［41］在細胞水平初步探究黃連生物堿對小鼠巨噬細胞非特異性免疫功能的影響實驗中，發(fā)現(xiàn)4種黃連生物堿對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能有不同程度的提高。

2.7 抗腫瘤抗癌近年研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有細胞毒性，可在體外抑制多種腫瘤細胞。通過阻滯癌細胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制癌細胞的蛋白質(zhì)和DNA合成，從而達到抑制腫瘤細胞的作用［42］。

YU ZHU等［43］在探討小檗堿對MG-63人骨肉瘤細胞潛在遺傳毒性效應(yīng)的影響中，通過DNA片段分析和流式細胞儀測定，發(fā)現(xiàn)小檗堿在濃度和時間依賴的方式上誘導(dǎo)MG-63細胞的凋亡明顯增加，與陰性對照相比，DNA損傷的依賴性增加。并且有研究表明，小檗堿可通過激活p38途徑誘導(dǎo)人直腸腺癌細胞自噬凋亡，抑制腫瘤生長活性［44］。

雄烷受體（CAR）調(diào)節(jié)肝外源性代謝和能量代謝，以及促進細胞生長和肝癌。據(jù)報告，小檗堿能夠進行細胞攝取和干擾肝癌HepG2細胞的染色質(zhì)，誘導(dǎo)細胞凋亡，細胞周期阻滯。能夠通過獨特的表觀遺傳修飾機制，改善CAR代謝途徑的機理，并由此得出，小檗堿以其獨特的藥理特性，有希望成為抗腫瘤輔助化療的一個候選者［45］。

2.8 其他該類總生物堿還具有止咳平喘及解毒的作用。南天竹種子從40%甲醇提取物中分離得到的去甲烏頭堿具有較為明顯的抵制組胺誘導(dǎo)氣管收縮作用。且粗提取物與三氧化二砷聯(lián)合用藥對三氧化二砷致肝及心肌損傷具有很好保護作用，降低三氧化二砷的毒性［46］。

3 結(jié)論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及人類生產(chǎn)生活的需求，中藥應(yīng)用越來越廣泛，小檗堿作為臨床上不可缺少的藥物，也越來越得到人們的重視，因此對含有小檗堿類中草藥的研究與開發(fā)具有重要的意義。

對小檗堿提取工藝的研究，國內(nèi)研究較多，但大多都是傳統(tǒng)提取方法，如醇提取、酸提取、酶解法等，時間較長，耗能較高，操作量大，目前較為常用的方法為醇提法。在傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上不斷改進，產(chǎn)生了一些新的提取方法，如閃式提取法，雖使提取率不斷提高，但衍生新的工藝方法目前還較少，且運用不廣泛，因此各種技術(shù)的聯(lián)用顯得尤為重要。

作為治療腹瀉、感染的老藥，小檗堿在降糖降脂、心血管疾病、抗腫瘤抗癌方面均有較好的效果，可作為治療糖尿病、心律失常、降壓以及防治癌癥的一種有效成分。小檗堿類生物堿與其他成分協(xié)同作用，在減少毒副作用以及避免過早出現(xiàn)“抗藥性”等諸多方面，具有較好的優(yōu)勢。但關(guān)于其在消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及不良反應(yīng)方面，研究的較少，且目前其藥理活性研究大部分停留在實驗階段或動物實驗階段，將藥物應(yīng)用于臨床，仍舊任重而道遠。