Box-Behnken效應面法優(yōu)化黃芩湯顆粒劑成型工藝

★ 王靜 王玉 李梅梅（1.成都市溫江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科 成都 611130；.四川百草精工生物科技有限公司 成都 611138）

黃芩湯顆粒劑源于1800年前張仲景所著《傷寒雜病論》中的“黃芩湯”，由黃芩、大棗、芍藥和甘草組成，古籍記載功效為清熱止血，和中止痛，主要用于治療傷寒，太陽與少陽合病，身熱口苦，腹痛下利。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩湯有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜解痙、抑菌抗炎等作用，臨床常用于急性胃腸炎、細菌性痢疾、腹瀉以及慢性結腸炎等疾病的治療［1］。近年來，來自耶魯大學的鄭永奇團隊發(fā)現(xiàn)了黃芩湯（代號PHY906）對于腫瘤患者放療或化療引起腹瀉的顯著改善作用，并對其作用機制進行了深入研究［2-6］，目前該項目已處于臨床Ⅱ期階段［7］。由于湯劑使用過程中口服劑量大，服用療程長，易滋生微生物導致霉變，并且在攜帶、儲存、運輸過程中多有不便，因此，本研究擬將黃芩湯劑改為顆粒劑以克服上述缺點。

在劑型改變過程中，涉及到工藝優(yōu)化和處方篩選等環(huán)節(jié)，需要同時考察多因素對實驗指標的影響，并對所得結果進行優(yōu)化。常用的考察方法包括單因素實驗、析因設計、均勻設計和正交設計等。單因素考察法條件優(yōu)選憑經(jīng)驗，且無法考察各因素間的相互作用，優(yōu)化效果局限性較大，通常需要與其他方法結合對工藝進行優(yōu)化；當需要考察的因素水平較多時，不適用析因設計，而使用較多的均勻設計、正交設計，也存在實驗精度較低，建立的數(shù)學模型預測功能差等問題。近年來，Box-Behnken效應面法（response surface methodology，RSM）由于適用于多因素多水平試驗設計，使用方便，優(yōu)選條件預測性好等優(yōu)點，國內外關注度很高，許多藥學工作者利用該法對制劑處方工藝進行優(yōu)化［8-11］。因此，本文利用單因素實驗結合Box-Behnken效應面法對黃芩湯顆粒劑成型工藝進行優(yōu)化。

1 儀器與材料

黃芩湯干浸膏（自制三批，批號：20160911、20160920、20160929）；糊精（天津博迪化工股份有限公司）；淀粉（國藥集團化學試劑有限公司）；蔗糖（天津市福晨化學試劑廠）；乙醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

BT125D分析天平（sartorius，德國賽多利斯）；FA61001C電子精密天平（上海精科天美）；PharmX?高剪切制粒機（Fluid Air，德國GEA集團）；Magnaflo?流化床系統(tǒng)（德國GEA集團）；BT100-2J精密蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

2 實驗方法

2.1 黃芩湯顆粒劑的制備精密稱取黃芩湯干浸膏適量，粉碎后過80目篩，備用；淀粉、糊精、蔗糖等輔料也過80目篩。按處方用量稱取黃芩湯浸膏細粉和淀粉、糊精，采用等量遞加法混合均勻，加入適量蔗糖矯味，混勻。將混合粉末置于高剪切制粒機中，在適當剪切速度下噴入一定量75%乙醇溶液制備濕軟材，軟材過20目篩制粒，流化床系統(tǒng)干燥，即得黃芩湯顆粒劑。

2.2 各考察指標的測定

2.2.1 顆粒溶化性測定按照《中國藥典》2015年版四部制劑通則0104顆粒劑項下“溶化性”檢查方法，測定顆粒劑溶化性。稱取供試品10g，加熱水200mL，攪拌，記錄完全溶解時間。規(guī)定顆粒劑應在5min內全部溶化，允許有輕微渾濁。

2.2.2 顆粒粒度測定按照《中國藥典》2015年版四部制劑通則0982第二法“雙篩分法”測定粒度分布。通過1號篩（10目）以及不能通過5號篩（80目）的顆粒判定為合格顆粒，計算合格顆粒收率。收率計算公式為：

合格顆粒收率（%）=合格顆粒（g）/總顆粒（g）×100

2.2.3 顆粒吸濕率的測定［8］取黃芩湯顆粒適量M1，置于已干燥恒重的稱量瓶中，精密稱定M2，放入含有飽氯化鈉溶液的干燥器中（RH=75±5%，溫度25℃），48h后，取出稱重M3，計算吸濕百分率，并觀察其外觀性狀的變化。

吸濕百分率（%）=（M3-M2）/M1×100

3 實驗結果

3.1 單因素實驗

3.1.1 輔料配比對黃芩湯顆粒劑質量的影響準確稱取黃芩湯浸膏400g，加入不同配比的輔料400g，輔料比例設定為糊精：淀粉分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，固定乙醇濃度、剪切制軟材時間和流化床干燥時間，考察不同糊精/淀粉配比條件下對顆粒劑質量的影響。由圖1A可知，隨著糊精/淀粉配比的增加，顆粒劑溶化時間明顯縮短，吸濕率也有下降趨勢，但顆粒合格率也逐漸降低，綜合考慮，確定糊精：淀粉為3∶1，此時，顆粒劑的各項指標處于相對較優(yōu)水平。

3.1.2 輔料用量對黃芩湯顆粒劑質量的影響準確稱取黃芩湯浸膏200g，糊精/淀粉配比為3∶1，固定乙醇濃度、剪切制軟材時間和流化床干燥時間，分別加入浸膏1、2、3、4、5倍量的輔料，考察不同輔料用量對顆粒劑質量的影響。由圖1B可知，隨著輔料用量的增加，顆粒劑溶化時間開始處于下降階段，但輔料用量超過4倍時，溶化時間明顯上升，且已超過5min；顆粒吸濕性也伴隨輔料用量的增加而升高，合格率未受明顯影響。后續(xù)工藝優(yōu)化重點考察1～4倍輔料用量范圍內對顆粒劑質量的影響。

3.1.3 乙醇濃度對黃芩湯顆粒劑質量的影響準確稱取黃芩湯浸膏200g，固定輔料配比及用量、剪切制軟材時間和流化床干燥時間，分別加入50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇制軟材，考察不同乙醇濃度對顆粒劑質量的影響。由圖1C可知，顆粒劑溶化時間、合格率隨乙醇濃度的增加，表現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢，吸濕率無明顯改變。后續(xù)工藝優(yōu)化重點考察60%～80%乙醇濃度對顆粒劑質量的影響。

3.1.4 剪切制軟材時間對顆粒劑質量的影響準確稱取黃芩湯浸膏200g，固定輔料配比及用量、乙醇濃度和流化床干燥時間，分別剪切10、20、40、60、80min制備顆粒，考察不同剪切時間對顆粒劑質量的影響。由圖1D可知，隨著剪切時間的增加，顆粒劑合格率先增加后降低，且伴隨著溶化時間的增加，表明長時間的剪切作用增加了顆粒內部的粘合性；吸濕率未表現(xiàn)出明顯變化。后續(xù)工藝優(yōu)化重點考察20～60min剪切時間對顆粒質量的影響。

3.1.5 流化床干燥溫度對顆粒劑質量的影響準確稱取黃芩湯浸膏200g，固定輔料配比及用量、乙醇濃度和剪切時間，分別于流化床中60、80、100、120、140℃烘干顆粒，考察不同干燥時間對顆粒劑質量的影響。由圖1E可知，隨著干燥溫度的增加，顆粒劑合格率有所增加，同時伴有溶化時間的延長，吸濕率未受明顯影響。后續(xù)工藝優(yōu)化重點考察80℃～120℃干燥條件下對顆粒質量的影響。

圖1 輔料配比（A）、輔料用量（B）、乙醇濃度（C）、剪切制軟材時間（D）、和流化床干燥溫度（E）、對顆粒劑質量影響的單因素試驗結果

3.2 Box-Behnken效應面法優(yōu)化黃芩湯顆粒劑處方工藝在文獻［9-13］調研基礎上，通過預實驗和單因素考察實驗，發(fā)現(xiàn)處方組成和制備工藝均為影響黃芩湯顆粒質量標準的重要影響因素。Box-Behnken效應面優(yōu)化過程中，以輔料/浸膏（X1）、乙醇濃度（X2）、剪切時間（X3），流化床干燥溫度（X4）為考察對象，以黃芩湯顆粒合格率（Y1/%）、溶化時間（Y2/min））及吸濕性（Y3/%）的“總評歸一值”（OD）Y為評價指標，進行4因素3水平的Box-Behnken效應面優(yōu)化，以確定黃芩湯顆粒劑的最優(yōu)成型工藝。

根據(jù)Hassan公式對各個指標進行均一化處理：

計算公式：對于越大越好的指標取值di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）

對于越小越好的指標取值di=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）

其中，Yi為實測值，Ymin和Ymax系指每一指標在不同次實驗中測得的所有值中的最小和最大值。

計算出各指標的di值后，OD=（d1×d2…×dk）1/k，k為指標數(shù)。

因素水平見表1，實驗結果見表2。

表1 實驗設計水平表

表2 Box-Behnken實驗設計表與效應值

3.2.1 二次回歸模型的建立以總評歸一值（OD）為因變量Y，利用Box-Behnken效應面法實驗軟件Design-Expert 8.0.6對影響因素進行回歸分析，得二次多元回歸模型為：

方差分析結果見表3。度為100.0℃。

表3 方差分析結果

按此成型工藝制備了3批黃芩湯顆粒劑，結果顯示3次樣品的OD值分別為0.8830、0.9706、0.9585，預測OD值為0.9033，偏差為-2.25%、7.45%、6.11%，驗證數(shù)據(jù)與預測結果較為接近，提示該模型具備較高的準確性和精密性，所優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

由表3可知，回歸方程P＜0.01，表明方差顯著，模型確定系數(shù)R2=0.9430，說明OD值與該方程的所包含的自變量之間呈顯著的多元回歸關系，實驗所建立的回歸方程能較好的對真實的曲面進行模擬，所用實驗方法比較可靠。模型

R-Squared=0.8993，說明該方程能解釋該實驗數(shù)據(jù)89.93%的變異性?？傮w看來，該模型擬合度良好，誤差小。所以可以用該回歸方程分析和預測不同制粒工藝下對黃芩湯顆粒劑質量的影響。從表3可知，輔料/浸膏、乙醇濃度、剪切時間和干燥溫度均對顆粒劑質量影響顯著；且輔料/浸膏、乙醇濃度和干燥溫度三者的交互作用對顆粒質量的影響也顯著，由此可知各實驗因素對實驗指標的影響不是單一的線性關系，而是呈曲面關系。

3.2.2 效應面預測與驗證應用Design-Expert 8.0.6實驗設計軟件繪制各指標與影響較顯著的2個自變量的等高線圖（另2個自變量設為中心點值，圖2所示），設計指標權重并以OD值對最佳工藝進行優(yōu)化：輔料/浸膏為2.5，乙醇濃度為70.0%，剪切制軟材時間為40.0min，流化床進口干燥空氣溫

圖2 輔料/浸膏、乙醇濃度、剪切時間和干燥溫度對顆粒劑質量影響的等高線（A1、B1、C1、D1、E1、F1）和效應面（A2、B2、C2、D2、E2、F2）

4 討論

中藥經(jīng)典名方復方制劑的研究對整個中醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展具有重要的推動作用。2015年國務院44號文《關于改革藥品醫(yī)療器械審批審評制度的意見》明確提出“簡化來源于古典經(jīng)典名方的復方制劑的審批”，2017年7月1日實施的《中醫(yī)藥法》以立法的形式明確來源于古代經(jīng)典名方的中藥復方制劑簡化注冊審批。國家食品藥品監(jiān)督管理局藥化注冊司主導的《中藥經(jīng)典名方復方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定（征求意見稿）》及相關申報資料要求已于2017年10月9日對外公開征求意見。表明醞釀已久的中藥經(jīng)典名方復方制劑簡化審批管理終于“落地”，為中藥制劑的開發(fā)提供了政策保障。

本研究在單因素試驗的基礎上，結合Box-Behnken效應面優(yōu)化法確定了黃芩湯顆粒劑成型工藝：輔料/浸膏比例為2.5，乙醇濃度為70.0%，剪切制軟材時間為40.0min，流化床干燥溫度為100.0℃。且三批驗證實驗發(fā)現(xiàn)觀察值和模型預測值之間的偏差小10%，表明該工藝穩(wěn)定可行。對實驗所得黃芩湯顆粒劑進行質量考察，該顆粒粒度適中，外觀均勻、美觀，溶化時間、水分、鑒別、醇浸出物、有效成分含量等均符合現(xiàn)行《中國藥典》相關要求，體現(xiàn)了Box-Behnken效應面法在優(yōu)化黃芩湯顆粒劑成型工藝應用中的可行性。