功能性組織工程氣管的研究進展及臨床應用現(xiàn)狀＊

張文雄，徐建軍

(南昌大學第二附屬醫(yī)院胸外科，南昌 330006)

嚴重氣管狹窄、原發(fā)氣管惡性腫瘤或鄰近器官惡性腫瘤的侵犯均需行氣管切除重建。當成人氣管切除長度超過1/2（嬰幼兒氣管的1/3）時，端端氣管吻合因極大的張力而導致吻合口撕裂等致命并發(fā)癥[1]。雖然同種異體氣管或異種氣管可以作為替代物，但伴隨移植氣管來源困難、終生免疫抑制治療等缺點，臨床上難以推廣。目前，組織工程已成為解決這一問題的潛在方法。新的氣管構架需要能夠被覆纖毛柱狀上皮橫向剛性但縱向柔韌的管狀支撐，同時達到能夠自我修復、再血管化以及無免疫排斥等要求。相關研究目前已有較多報道，但這些組織工程氣管距離臨床實際要求仍有一些差距[2，3]。以下，我們針對構建組織工程氣管幾個關鍵因素進行分析。

1 管狀支架構建

管狀支架的構建對附著細胞的生物學活動有很大的影響。一個好的支架應該有利于細胞粘附、遷移、增殖和分化，同時還能夠促進組織再生和重塑，不引起局部炎癥反應和免疫排斥反應。因此，支架制作時應采用三維多孔結構，以利于細胞生長、營養(yǎng)輸送、代謝物清除以及新生血管再生[4]。為防止氣管塌陷，支架結構對機械強度有一定要求，而氣管支架的強度很大程度上依賴于材料的選擇[5]。合成材料往往具有較好機械強度，但缺乏天然生物材料所特有的生物活性?，F(xiàn)近，合成材料和生物材料的結合成為主流，這種結合同時具備了良好的機械強度和生物活性。

管狀支架的軟骨結構主要由非負重部位軟骨組織采集的軟骨細胞來制作，如鼻中隔、外耳等部位[6]。Kojima等運用鼻中隔軟骨以及氣管源性軟骨細胞制作組織工程氣管，發(fā)現(xiàn)他們和自然氣管有相似的機械特性[7]。Wu等通過培養(yǎng)制作片狀軟骨細胞團聚體，并將它們纏繞在硅膠管上植入兔皮下8周促進軟骨組織成熟。結果發(fā)現(xiàn)，植入后的軟骨組織在拆除硅膠管后仍保留管狀結構，雖然其機械強度較自然氣管明顯減低[8]。這提示了利用無支架的軟骨細胞制作組織工程氣管管狀支架的可能性。作為替代，干細胞越來越多被用于軟骨組織的制備，其中骨髓間充質(zhì)干細胞因其來源廣、易分離等特點成為運用最多的干細胞來源[9]。Fuchs等比較了軟骨細胞和軟骨分化的骨髓間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)兩者在體內(nèi)移植后的糖胺聚糖、Ⅱ型膠原和彈性蛋白的表達水平均無明顯差別[10]。Kunisaki等誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化制作工程氣管軟骨支架，其輪廓與自然氣管細胞外基質(zhì)框架相似[11]。Dikina等在環(huán)狀模型中將骨髓間充質(zhì)干細胞分化形成軟骨細胞環(huán)，進而通過疊環(huán)法培養(yǎng)制作無支架軟骨管。這種技術不僅提高了軸向平面的機械強度，同時減少了軟骨環(huán)與連接支架的縫合過程[12]。

近年，一些學者將注意力轉(zhuǎn)移到具有天然細胞外基質(zhì)的脫細胞生物組織和器官。這些生物支架材料固有的三維結構和生物特性，有利于細胞的貼附生長和功能恢復[13]。將組織中細胞核和細胞質(zhì)成分去除，僅保留的骨架成分能明顯減少排斥反應的風險而不影響力學性能[14]。Conconi等通過生物酶法洗滌細胞成分獲得細胞外基質(zhì)骨架，支持軟骨細胞和氣管上皮細胞粘附[15]。Seguin等采用深低溫凍存法獲得了相似的去細胞效果[16]。Butler等運用酶法去細胞的同時，輔助運用真空環(huán)境進行輔助，能達到更好的去細胞效果并縮短制備[17]。Xu等運用微孔化處理去細胞同種異體去細胞氣管支架并結合自體軟骨細胞植入，所得到的移植氣管在體內(nèi)實驗中能達到較原生氣管更好的機械強度[18]。Jungebluth等在動物實驗中證實，豬氣管在17次反復酶法去細胞后基本消除MHCⅠ類和Ⅱ類抗原[19]。這項研究從理論上證實將動物氣管用于人氣管移植的可行性，這將解決供體氣管來源不足的問題，但該技術用于臨床仍需大量驗證。主動脈因其抗原少、滋養(yǎng)血管少以及不分泌粘液等特點，在一些報道中被用來做氣管替代物。Martinod等在羊體內(nèi)實驗中證實了血管作為氣管移植物的可行性[20]。Wurtz等運用同種異體主動脈對6名氣管涎腺型癌患者進行氣管移植，所有移植物均能得到很好的再血管化和部分上皮被覆，術后患者均能很好耐受[21]。

隨著3D打印技術的成熟，其在組織工程中的運用受到了重視。較傳統(tǒng)方法，運用3D打印制造氣管支架更符合個體化的氣管形態(tài)要求，并可以明顯減少制備時間。Bhora等運用聚己內(nèi)酯制作3D移植氣管并在豬體內(nèi)實驗進行驗證，術后2周病理檢查提示吻合口明顯的肉芽組織增生伴部分上皮化[22]。Rehmani等的研究取得類似的結果，5/7的實驗動物（豬）生存時間超過3個月同時不影響生長[23]。Gao等同樣運用聚己內(nèi)酯制作網(wǎng)狀3D移植氣管，并在其上植入軟骨細胞，移植后兔最長存活時間達10周，最常見的死亡原因為肉芽組織增生所致的嚴重氣管狹窄[24]。

2 氣管再上皮化

移植氣管上皮層缺失可導致肉芽組織增生以及痰液潴留，嚴重的可致致命的氣道阻塞[12，25]。雖然受體氣管上的纖毛上皮細胞能移行至供體氣管上，但這個過程需要數(shù)月時間。因此有研究表明，上皮細胞和軟骨細胞的種植在氣管移植物存活中均不可缺少，缺少其中1種或2種均缺少時常因氣道阻塞和感染導致移植失敗[26]。以往，組織工程氣管上皮層制備主要提取氣管、鼻中隔或鼻甲的呼吸上皮，其種植后可進一步分化產(chǎn)生纖毛上皮細胞、杯狀細胞以及基底細胞[27]。然而，呼吸道上皮的獲取從技術上較困難且數(shù)量少，難以滿足組織工程氣管制備的需求。因此，干細胞在上皮化中的運用日漸受到重視，Batioglu等在兔體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，植入脂肪組織來源的組織間充質(zhì)干細胞能明顯降低脫細胞氣管移植術后氣道狹窄、感染等并發(fā)癥的發(fā)生率及嚴重程度[28]。Kim等發(fā)現(xiàn)，皮膚上皮干細胞植入能很好的分化為氣管上皮細胞和軟骨細胞，這提示將皮膚上皮干細胞用于氣管上皮再生的替代細胞來源的可能性[29]。

上皮細胞與間充質(zhì)間的相互作用在多種器官的形成過程中起到重要作用。Goto等發(fā)現(xiàn)，與皮膚和氣管中成纖維細胞共同培養(yǎng)的氣管上皮細胞能促進假復層柱狀上皮以及纖毛的形成，其中杯狀細胞和基底細胞的比率和自然氣管相似，這種現(xiàn)象在單獨培養(yǎng)氣管上皮細胞時是不存在的[30]。Kobayashi等發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細胞能促進氣管上皮細胞的分化和上皮重建，形成和正常氣管相似的假復層纖毛柱狀上皮層[31]。這表明，氣管上皮細胞層的形成受成纖維細胞分泌的可溶性因子介導。因此，雙層細胞種植（氣管上皮細胞+成纖維細胞）的概念被提出，在體內(nèi)模型（羊）中發(fā)現(xiàn)該結構能較好的支持上皮細胞層形成且不產(chǎn)生明顯的纖維化[32]。除了成纖維細胞外，血管內(nèi)皮細胞在氣管上皮的形成和修復中也發(fā)揮了重要的作用。Zani等發(fā)現(xiàn)，上皮細胞和內(nèi)皮細胞均能促進去細胞氣管骨架的再上皮化，且兩者同時存在時效果最佳。其中上皮細胞限制組織損傷和間質(zhì)增生，而內(nèi)皮細胞維持上皮層和血管的穩(wěn)定[33]。由此，在未來組織工程氣管的制備中，除了需要種植軟骨細胞和氣管上皮細胞外，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞也應該得到重視。

3 再血管化

血管化對于移植物的存活非常重要，特別是大而厚的移植物。對于短的移植氣管，血管內(nèi)皮細胞能從固有氣管內(nèi)向生長并及時形成新生血管以維持上皮的存活。然而，長段氣管移植時，新生血管較難達到移植氣管的中點，因而易致缺血改變。移植氣管缺血能誘發(fā)較多致命的并發(fā)癥，如肉芽組織增生、氣管狹窄等[12]。Luo等在兔模型中將移植氣管植入胸骨舌骨肌內(nèi)進行血管化預處理。結果顯示，進過預處理的移植氣管較對照組具有更好的纖毛上皮化生以及軟骨結構穩(wěn)定性[34]。Elizabeth等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過再血管化的移植氣管較單純?nèi)ゼ毎麣夤苣苊黠@降低術后氣管狹窄的發(fā)生[35]。這表明，移植物的早期血管化不僅能維持細胞活性，對移植物結構的穩(wěn)定性也有很大的影響。

以下介紹幾種加速新生血管形成的方法：1.在工程氣管制備時，植入血管內(nèi)皮細胞，不僅能維持上皮層和血管的穩(wěn)定，也能加速新生血管的再生；2.血管生成因子、重組人促紅細胞生成素和血管內(nèi)皮生長因子等均在研究中證實能加快移植氣管新生血管的形成[36，37]；3.在移植前將組織工程氣管進行血管化預處理，如將工程氣管植入大網(wǎng)膜等富血管的受體組織中進行先期培養(yǎng)[38]；4.在器官移植時同期運用受體富血管組織進行包繞，最常用的組織是帶血管的大網(wǎng)膜和肌瓣。這些富含血管的組織能夠迅速的使移植氣管再血管化以減少組織缺血范圍和程度[39]。

4 氣管移植的臨床運用

氣管移植臨床已有較多報道，2008年，Macchiarini等報道了第一例組織工程氣管移植案例[40]。在去細胞同種異體氣管支架上植入上皮細胞和軟骨細胞后，置入生物反應器中培養(yǎng)96h。在移植后5年的隨訪中，患者無明顯排斥反應，生活質(zhì)量顯著改善，雖然在吻合口部位存在瘢痕性狹窄，但并不妨礙患者的正常生活[41]。氣管功能測試表明，患者已恢復正常的肺功能、咳嗽敏感性和排斥力。

Delaere等報道了另一個同種異體氣管移植的成功病例。術前將移植氣管置入患者前臂皮下進行預血管化，34d后在氣管后壁植入患者口腔黏膜細胞并再上皮化4個月。雖然移植氣管并未進行去細胞處理，但術前移植氣管的上皮細胞已經(jīng)消失，患者術后呼吸功能明顯改善[42]。相較于前一病例，作者推測，將移植氣管進行異位移植后，供體的氣管上皮細胞會被受體潛移默化的排斥掉，而軟骨骨架因其無血管性而逃脫了免疫監(jiān)視。

Elliot等報道了第一例兒童（10歲）組織工程氣管移植病例[43]。移植氣管采用脫細胞的同種異體氣管骨架被覆未分化的自體骨髓間充質(zhì)干細胞以及呼吸上皮細胞補片。氣管移植后配合使用重組人促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子和轉(zhuǎn)化生長因子促進血管再生、干細胞軟骨分化等。術后1周能發(fā)現(xiàn)血管生成證據(jù)，15個月后氣管纖毛上皮化完成，18個月后移植氣管恢復正常的機械強度。在4年的隨訪中，患者恢復正常的生活。

Jungebluth等報道首例運用納米復合材料（多面體倍半硅氧烷納米銀微粒+聚氨基甲酸乙酯，POSS-PCU）構建移植氣管支架被覆未分化的自體骨髓間充質(zhì)干細胞用于臨床氣管移植病例[44]。POSS-PCU具有良好的生物相容性、非生物降解性、溫和的免疫原性、高機械強度、易延展性和無毒性，使其適合于組織工程中的應用。相比于同種異體氣管支架，納米復合材料更加容易制備以滿足患者的需求?；颊咝g后1周出現(xiàn)細菌和真菌感染，2個月后氣管內(nèi)鏡活檢提示表皮細胞再生和新生血管的形成，5個月后患者恢復正常呼吸功能。

Fabre等報道了12例運用自體組織構建移植氣管的病例，他們采用帶血管蒂皮瓣（前臂內(nèi)側獲?。﹥?nèi)襯片狀肋軟骨環(huán)，皮瓣滋養(yǎng)血管與胸廓內(nèi)動靜脈吻合。術后所有患者均出現(xiàn)不同程度肺部感染癥狀，經(jīng)保守治療后均康復出院。腫瘤患者術后5年生存期達64.8%，主要死亡原因為腫瘤復發(fā)。這種移植氣管的制備免除了術后抗排斥藥物的使用并且明顯縮短了準備時間，在世界范圍內(nèi)得到了一定的認可和推廣[45]。

然而，并不是所有接受移植的患者均恢復了正常的生活，一些患者死于潛在的并發(fā)癥。Martinod等報道1例移植失敗案例，15歲女性患者因嚴重氣管狹窄接受干細胞種植組織工程氣管移植，患者3周后死于急性胸內(nèi)出血所致的氣管壓迫窒息[46]。Berg等對一位76歲氣管狹窄患者進行氣管移植，移植氣管采用去細胞同種異體氣管+自體干細胞植入，患者23d后死于心跳驟停[47]。

5 面臨的問題

組織工程氣管移植雖有一些成功報道，但作為常規(guī)技術在臨床上廣泛使用仍存在一些問題亟待解決。為了更好的了解工程支架和移植細胞在體內(nèi)的過程，需要進行更多的前期動物實驗，以確保臨床應用前的安全性、有效性和可重復性。

組織工程氣管面臨的最大障礙是血管化太慢不能滿足移植氣管中活細胞的需求。血管從上下吻合口處穿過術后的移植氣管，需要數(shù)月的時間才能達到長氣管的中點，從而導致氣管中部的缺血性壞死。組織壞死導致炎癥反應和氣管狹窄。雖然上面已經(jīng)提出并實驗了幾種促進血管形成的方法，但這些技術并沒有達到完全令人滿意的結果。

目前，脫細胞的同種異種氣管移植似乎是一種理想的支架材料，其基質(zhì)組成和微觀結構和供體氣管組織相同。此外，完整的脫細胞能明顯降低免疫排斥的風險，并由受體細胞促進支架的內(nèi)皮化。然而，脫細胞同種異體氣管移植的供體數(shù)量嚴重不足限制了其臨床應用。此外，還需要更加有效、高效的脫細胞技術以減少處理時間，同時保留所有有利于上皮再生的生物學特性。

另一個關于組織工程氣管的問題是移植氣管的增長（直徑和長度），這對于兒童患者是至關重要的。因為兒童患者的身高隨著年齡的增長而增加，移植氣管缺乏成長性可能妨礙兒童患者的生長，甚至威脅生命。因此，在兒童患者移植氣管的設計中，必須要確保氣管的成長性，雖然Hamilton等的研究表明移植氣管的兩端直徑能夠增加，但這種增加可能是由機械牽拉引起的[48]。

雖然有許多較好的組織工程氣管已經(jīng)過設計使用，但往往都是針對特定受體定制的。這大大影響氣管制造的一致性，而且造成移植物的質(zhì)量差異很大。如何能夠規(guī)范的、批量的制備合格的移植氣管仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。此外，移植物的儲存、運輸還有足夠的保質(zhì)期也是亟待解決的問題。

6 展望

氣管置換通常不是救命的手術，但可以極大的改善患者癥狀和預后。綜前所述，組織工程氣管因其成本低、可批量制造以及制備時間短等特點是移植氣管的重要選擇。雖然，有較多氣管移植成功的病例報道。但制作一個全功能的組織工程氣管仍有很多困難需要解決，尤其在移植物再血管化以及組織功能化方面。其中，血管生成研究的最新進展可能是實現(xiàn)這一目標的關鍵。相信在將來，具有全功能化的組織工程氣管廣泛用于臨床不再是夢想。