糞便生物標志物在炎癥性腸病診療中的應(yīng)用進展

鄭 靜，張 鐵，韓呈武 綜述，曹永彤 審校

(中日友好醫(yī)院檢驗科，北京 100029)

炎癥性腸病(IBD)是一類慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)及少部分未分類結(jié)腸炎。IBD最常見臨床表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液血便，病程遷延，緩解與復(fù)發(fā)交替，沒有根治方案，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量。近年來，IBD在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。內(nèi)鏡和組織病理檢查是評價IBD疾病活動度的金標準，但內(nèi)鏡檢查是一項侵入性檢查，需要做腸道準備，且耗時長、費用高，對患者，尤其是兒科患者是一種痛苦的體驗。因此，需要一種或一類無創(chuàng)、可靠、方便、經(jīng)濟的能準確反映腸道炎癥活動性的標志物來協(xié)助IBD的診療和動態(tài)監(jiān)測。目前，臨床常用于評估IBD疾病活動度的實驗室標志物主要有C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)及降鈣素原(PCT)等。但是這些指標多綜合反映全身炎癥，特異度及靈敏度有限。而糞便生物標志物(FM)因與腸道黏膜直接接觸，在反映腸道黏膜炎癥方面可能更為準確和靈敏，對于IBD的診療具有重要意義[2]。目前用于IBD診療研究較多的FM是糞鈣衛(wèi)蛋白(FC)和糞乳鐵蛋白(FL)，也有部分研究表明S100A12、丙酮酸激酶(PK)M2型(PKM2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、新喋呤、白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-17A及腫瘤壞死因子(TNF)-α可作為IBD的FM[3-4]。下面就FM在IBD診療中的應(yīng)用進展進行綜述如下。

1 可應(yīng)用于IBD診療的FM概述

1.1FC 鈣衛(wèi)蛋白是一種相對分子質(zhì)量為3.6×104的鈣鋅結(jié)合蛋白，是由兩個異源鈣結(jié)合蛋白(S100A8和S100A9)組成的二聚體，屬于S100蛋白家族成員，主要來源于中性粒細胞，占其細胞質(zhì)蛋白的60%，小部分來源于單核細胞和活化的巨噬細胞[5]。在IBD中，尤其在活動期，黏膜中炎癥細胞浸潤明顯，脫落入腸腔，導(dǎo)致糞便中FC明顯升高。FC在糞便中勻質(zhì)存在，能抵抗細菌和蛋白酶降解作用，在室溫下性質(zhì)穩(wěn)定，最長可保存1周，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行定量檢測[4]。研究發(fā)現(xiàn)FC與IBD疾病活動指數(shù)和內(nèi)鏡下活動度評分相關(guān)，且靈敏度和特異度均高于CRP[6]。中華醫(yī)學會消化病學分會《IBD診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》中建議有條件可將FC作為輔助檢查[7]。

1.2FL 乳鐵蛋白是一種相對分子質(zhì)量為8.0×104的糖蛋白，可與鐵結(jié)合，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。乳鐵蛋白主要儲存在于中性粒細胞、單核巨噬細胞和腸道內(nèi)皮細胞中，它通過限制鐵利用來抑制細菌的生長。在炎癥狀態(tài)下，中性粒細胞和單核巨噬細胞釋放乳鐵蛋白，因此可以作為一種炎性標志物。FL能抵抗蛋白酶水解作用，在室溫下性質(zhì)穩(wěn)定，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測[4]。研究表明，F(xiàn)L在IBD患者中明顯升高，中度CD或UC患者FL的水平均高于輕度或緩解期患者[8]。

1.3新喋呤 新喋呤是人體內(nèi)三磷酸鳥苷代謝、四氫生物喋呤合成過程中產(chǎn)生的一種低分子嘧啶化合物。主要由活化的T淋巴細胞分泌的IFN-γ刺激單核-巨噬細胞產(chǎn)生，是反映體內(nèi)淋巴細胞-巨噬細胞軸所介導(dǎo)的細胞免疫狀態(tài)的主要標志物[9]。據(jù)報道，在一些免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病中，如移植物抗宿主病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒敗血癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性胰腺炎等疾病，患者血液和尿液標本中的新喋呤會明顯升高[10]。有研究表明糞便新喋呤也是評價IBD活動性的一種可靠的生物標志物，且其在預(yù)測IBD患者內(nèi)鏡下疾病活動性的準確性與FC相當[11]。

1.4MMP-9 MMP是一種含鋅離子催化中心的肽鏈內(nèi)切酶，參與降解細胞外基質(zhì)和基底膜，從而引起組織或器官損傷。MMP-9 主要由結(jié)腸上皮細胞和中性粒細胞釋放，參與細胞外基質(zhì)(ECM)的降解，造成腸黏膜組織的損傷[12]。研究表明UC患者腸黏膜MMP-9表達明顯增高，不同活動度組間表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示UC患者腸黏膜MMP-9表達上調(diào)與嚴重度相關(guān)[13]。KOLHO等[14]研究顯示活動期IBD 患者糞便中MMP-9水平明顯升高，并且UC患者高于CD患者。糞便MMP-9為黏膜損傷的一項標志物，可用來評價UC患者的黏膜炎癥和損傷情況。

1.5S100A12 S100A12是S100蛋白家族成員之一，主要表達于中性粒細胞，占其細胞質(zhì)蛋白的5%，小部分來源于單核細胞和巨噬細胞等。S100A12具有上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附分子、活化并趨化炎性細胞和抗菌活性等功能[3]。KAISER等[15]研究發(fā)現(xiàn)IBD患者糞便中S100A12平均水平高于對照組和腸易激綜合征(IBS)組,且活動期高于緩解期。HEIDA等[16]也發(fā)現(xiàn)與健康個體相比，初診兒童和青少年IBD患者的糞便S100A12明顯增高。目前S100A12應(yīng)用于IBD診療的研究相對較少,未來尚需要更多研究來評估其在IBD診療中的應(yīng)用價值。

1.6PKM2 PK是細胞糖酵解通路的關(guān)鍵酶。人體內(nèi)PK有L、R、M1和M2共4種同工酶，其中L型主要表達在代謝旺盛的肝臟、腎臟和小腸等組織，R型主要表達于紅細胞,M1型表達于肌肉和腦，M2型表達于胚胎組織、干細胞和腫瘤細胞[4]。早前PKM2的研究主要集中在腫瘤的篩查和早期診斷，近來人們發(fā)現(xiàn)IBD患者糞便PKM2水平明顯高于健康志愿者。PKM2可以在糞便中穩(wěn)定存在2 d，穩(wěn)定性略遜于FC和FL[17]。

1.7其他 盡管IBD發(fā)病機制尚未研究清楚，但研究表明炎性因子和趨化因子，如IL-1、IL-6、IL-17A和TNF-α等參與了IBD 的炎性反應(yīng)，其在糞便中的水平可能在一定程度上反映IBD 疾病活動性[4]。另外，腸道微生物感染在IBD發(fā)病中起重要作用。FUKUDA等[18]通過末端限制片段長度多態(tài)性(T-RFLP)的方法分析UC 患者和健康對照組的腸道微生物群，通過判別分析，發(fā)現(xiàn)判別分數(shù)(Ds)隨疾病活動性增加而降低，可能成為UC疾病活動性的生物標志物。這些FM由于本身性質(zhì)不穩(wěn)定，或沒有簡便易行的檢測手段，相關(guān)研究較少，目前并沒有應(yīng)用于IBD臨床診療。

2 FM在IBD診療中的應(yīng)用

2.1應(yīng)用于IBD的診斷和鑒別診斷 IBS的臨床表現(xiàn)與IBD類似，但IBS患者無腸道炎癥細胞浸潤，而IBD患者腸道黏膜存在程度不等的中性粒細胞浸潤，故中性粒細胞來源的炎性標志物可以用來鑒別IBD和IBS。VAN RHEENEN等[19]進行的一項納入6個成人研究(670例)和7個兒童研究(371人)的Meta分析表明FC能夠準確鑒別IBD與IBS。在成人中，F(xiàn)C診斷IBD的靈敏度為93%，特異度為96%；在兒童和青少年中，其靈敏度和特異度分別為92%和76%。通過FC篩查將使67%的成人和35%的兒童避免不必要的內(nèi)鏡檢查，但由于假陰性結(jié)果，6%的成人和8%的兒童可能會診斷延遲。KOLHO等[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C可以較好地鑒別兒童IBD和非IBD患者，靈敏度為81.8%，特異度為96.3%，受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.944 (95%CI為 0.907～0.981)。而BORKOWSKA等[8]發(fā)現(xiàn)FL(>13.3 μg/ g)區(qū)分兒童IBD和對照組的靈敏度和特異度分別為80.7%和92.7%。MENEES等[20]的Meta分析表明CRP≤0.5 mg/dL或FC≤40 mg/ kg基本上可以從存在IBS癥狀的患者中排除IBD。MINISTRO等[2]認為以臨床區(qū)分IBS與IBD為目的設(shè)定cut-off值，F(xiàn)C<50 mg/kg為陰性，50～150 mg/kg為弱陽性，>150 mg/kg為陽性；FL<7.25 mg/kg可考慮為陰性。KAISER等[15]研究發(fā)現(xiàn)IBD患者糞便中S100A12平均水平高于IBS患者，在鑒別IBD和IBS方面其靈敏度、特異度分別為86%和96%。ANNAHAZI等[12]研究顯示UC患者的糞便 MMP-9明顯升高，cut-off值為0.245 ng/mL時可以較好地區(qū)分UC 和IBS或健康志愿者，靈敏度為85.1%，特異度為99.99%，AUC為0.939。盡管各類研究的病例人群有差異，各標志物的單位不統(tǒng)一，cut-off值差異很大，但大多數(shù)研究數(shù)據(jù)表明，IBD患者的FM水平高于健康人群，可考慮用于疑似IBD患者的初篩。

2.2評價IBD疾病活動度 在IBD活動期，黏膜表面炎癥細胞浸潤明顯，相應(yīng)的糞便中炎癥細胞和炎性因子增多。研究表明，活動性IBD患者中FC水平明顯升高，并與內(nèi)鏡及組織病理學觀察到的腸道黏膜炎癥浸潤程度一致。ZITTAN等[21]發(fā)現(xiàn)，在UC患者中，F(xiàn)C與臨床Mayo評分和內(nèi)鏡下Mayo評分相關(guān)(r=0.63和r=0.96，P<0.000 1)；在CD患者中，F(xiàn)C與內(nèi)鏡下疾病活動度相關(guān)(r=0.61，P<0.000 1)。SCHOEPFER等[6]的研究顯示，F(xiàn)C>50 mg/kg預(yù)測黏膜炎癥的靈敏度為93%，特異度為71%。FC與內(nèi)鏡下疾病活動度相關(guān)性最高，優(yōu)于其他臨床指標，包括CRP、白細胞和CD活動指數(shù)(CDAI)等。LABAERE等[22]則發(fā)現(xiàn)FC檢測輕度UC的靈敏度為71%～100%，檢測中度至重度UC的靈敏度為100%，特異度為67%～86%；而在CD中，F(xiàn)C只能區(qū)分緩解和中度至重度疾病，靈敏度為83%～86%，特異度為75%。但SHIMOYAMA等[23]在122例無結(jié)腸受累的CD患者中的研究表明FC水平與小腸炎癥程度呈正相關(guān)。

除了FC，F(xiàn)L和MMP-9也被證明與IBD疾病活動度相關(guān)。SIPPONEN等[24]的研究發(fā)現(xiàn)FL與內(nèi)鏡下疾病活動度相關(guān)，靈敏度為66%，特異度為92%，優(yōu)于CDAI或CRP。ANNAHAZI等[12]的研究則提示在評估IBD疾病活動度方面MMP-9要優(yōu)于FC，其與Mayo評分和內(nèi)鏡下活動度均相關(guān)。cut-off值為2.38 ng/mL時，MMP-9可以較好地區(qū)分活動性和緩解期UC,靈敏度為97.1%，特異度為83.3%。FM(如FC、FL、MMP-9等)水平與IBD內(nèi)鏡下評分及臨床指數(shù)等具有較好的相關(guān)性，可以輔助內(nèi)鏡檢查，用來評估IBD疾病活動度，監(jiān)測疾病進程。

2.3評價療效 目前，IBD患者的治療目標已經(jīng)由臨床癥狀緩解轉(zhuǎn)向達到腸道黏膜愈合，但尚沒有黏膜愈合的統(tǒng)一定義，其主要評價方法是內(nèi)鏡及病理組織學檢查。一般認為黏膜愈合的標準為Mayo評分為0。KIM等[25]通過病例回顧性研究發(fā)現(xiàn)，UC患者中黏膜愈合者(Mayo評分0)較未達到黏膜愈合的患者臨床緩解期更長。

研究發(fā)現(xiàn)FC和FL是黏膜改善的可靠標志物，內(nèi)鏡顯示對治療有應(yīng)答者的FM趨于正常，而在大多數(shù)內(nèi)鏡下無應(yīng)答者FM仍然異常[26]。GUIDI等[27]發(fā)現(xiàn)，對TNF-α治療有應(yīng)答者FC水平低于無應(yīng)答者。FC≤168 μg/g預(yù)測持續(xù)的臨床反應(yīng)性的靈敏度為83%，特異度為76%。預(yù)測黏膜愈合(FC≤121 μg/g)的靈敏度和特異度分別為79%和57%。而HASSAN等[28]檢測了44例難治性UC患者接受英夫利昔單抗治療前后的血清和糞便的生物標志物，發(fā)現(xiàn)在所有測試參數(shù)中，F(xiàn)C對臨床緩解(AUC=0.826)和黏膜愈合(AUC=0.949)具有最好的預(yù)測價值。YAMAGUCHI等[29]也得到類似結(jié)果，F(xiàn)C預(yù)測Mayo 0/1的AUC為0.869，優(yōu)于CRP、ESR等指標。PATEL等[30]發(fā)現(xiàn)在UC中，F(xiàn)C≤60 μg/g可以預(yù)測深度緩解(AUC為 0.92，靈敏度為86%，特異度為87%)和更深度緩解(AUC為0.91，靈敏度為83%，特異度為90%)。上述研究表明，F(xiàn)C在一定程度上可以作為內(nèi)鏡的替代指標，用于評價患者對治療方案的反應(yīng)性，及時調(diào)整治療方案；同時也可用于預(yù)測臨床緩解和黏膜愈合。

2.4預(yù)測疾病的復(fù)發(fā) 緩解期IBD雖然沒有癥狀，但腸黏膜炎性浸潤可能依然存在，當炎癥細胞數(shù)達到一定閾值后，就會復(fù)發(fā)。FM能夠檢測到臨床癥狀不明顯的黏膜炎癥，且與IBD內(nèi)鏡下評分具有較好的相關(guān)性，因此可用于預(yù)測復(fù)發(fā)風險[3,5]。LOBATON等[31]檢測內(nèi)鏡下提示炎癥活動的無癥狀患者的FC，發(fā)現(xiàn)81.8%的患者FC水平≥280 μg/g。GARCIA-SANCHEZ等[32]對135例IBD臨床緩解患者的前瞻性病例對照研究顯示，復(fù)發(fā)患者的FC水平(444 μg/g)高于維持緩解者(112 μg/g，P<0.01)。FC>200 μg/g的CD患者復(fù)發(fā)的風險比低FC水平患者高4倍；而FC>120 μg/g的UC患者復(fù)發(fā)的風險比低FC水平者高6倍。GISBERT等[33]長期隨訪163例臨床緩解期IBD患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)患者FC水平[(239±150)μg/g]高于持續(xù)緩解者[(136±158)μg/g，P<0.001],高FC(>150 μg/g)或FL陽性的患者復(fù)發(fā)風險更高。TIBBLE等[34]發(fā)現(xiàn)FC(>50 mg/L)預(yù)測IBD復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度分別為90%和83%。OSTERMAN等[35]研究表明在FC水平較高的緩解期UC患者中，增加美沙拉秦的劑量可降低FC水平，且復(fù)發(fā)率降低。高FC水平(> 200 μg/g)的患者較早出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。以上數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)C或FL可用于預(yù)測IBD的復(fù)發(fā)，高水平的FC或FL提示復(fù)發(fā)風險較大。

2.5術(shù)后監(jiān)測 近來多個研究證實FC可應(yīng)用于IBD患者腸切除術(shù)后監(jiān)測。YAMAMOTO[36]針對腸切除術(shù)后的CD患者的研究表明，F(xiàn)C水平升高的患者內(nèi)鏡下復(fù)發(fā)的發(fā)生率(75%)明顯高于維持低水平的患者(9%)。 FC>140 μg/g對內(nèi)鏡下復(fù)發(fā)的預(yù)測靈敏度為75%，特異度為91%，陽性預(yù)測值(PPV)為75%，陰性預(yù)測值(NPV)為91%。WRIGHT等[37]也發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸切除術(shù)后6個月疾病復(fù)發(fā)患者的FC水平(275 μg/g)大于持續(xù)緩解的患者(72 μg/g,P<0.001)，F(xiàn)C>100 μg/g預(yù)測內(nèi)鏡下復(fù)發(fā)的靈敏度為89%，特異度為58%。LOPES等[17]針對發(fā)生吻合口狹窄的CD患者研究發(fā)現(xiàn)，在評估內(nèi)鏡下復(fù)發(fā)方面，F(xiàn)C>90.85 μg/g的靈敏度為95.5%，特異度為69.2%，PPV為72.4%，NPV為94.7%；而FL>5.6 μg/g的靈敏度為77.3%，特異度為69.2%，PPV為68%，NPV為78.4%。因此，F(xiàn)C和FL可作為無癥狀吻合口狹窄的CD患者內(nèi)鏡下復(fù)發(fā)的良好預(yù)測指標。對于腸切除術(shù)后的IBD患者，術(shù)后連續(xù)監(jiān)測FC或FL水平能有效預(yù)測疾病復(fù)發(fā)，減少不必要的內(nèi)鏡檢查。

綜上所述，F(xiàn)M相較于血清學標志物，對腸道炎性反應(yīng)具有更好的靈敏度和特異度。大量研究數(shù)據(jù)證實，F(xiàn)M，尤其是FC，可用于協(xié)助診斷IBD，評估藥物治療效果，動態(tài)監(jiān)測疾病活動度，并判斷復(fù)發(fā)風險。

3 FM應(yīng)用于IBD診療的局限性

盡管上述多項研究表明，F(xiàn)M對于IBD的鑒別、活動性判斷、復(fù)發(fā)的預(yù)測及藥物療效的評估有很高的價值。但需要注意的是其在IBD診療中的應(yīng)用也存在一定局限性：(1)特異度欠佳。以FC為例，在細菌等引起的感染性腹瀉中，腸道功能不全及其他原因致腸道黏膜滲透性升高的情況下，F(xiàn)C水平也會明顯升高；在結(jié)腸腫瘤患者中，F(xiàn)C水平也明顯高于健康對照組。另外消化吸收狀態(tài)，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、非甾體抗炎藥(NSAIDs)攝入均會影響檢測結(jié)果[5]。(2)綜合目前研究數(shù)據(jù)，F(xiàn)C 和 FL cut-off值范圍很寬泛，靈敏度和特異度數(shù)據(jù)差異很大?？赡苡幸韵略颍?1)未細分疾病類型是UC還是CD；疾病部位在于結(jié)腸還是小腸；疾病活動度高還是低；術(shù)前還是術(shù)后等。(2)檢測方法，LABAERE等[22]比較了6種FC的檢測方法，發(fā)現(xiàn)不同檢測方法的定量值相差5倍，說明檢測方法需要設(shè)定統(tǒng)一的標準，規(guī)范化。 檢測時間點不同。所以，在以后的研究中需要細分疾病類型、疾病活動度和檢測時間點，這樣才能得到更準確可信的數(shù)據(jù)。(3)使用FM來評估IBD患者治療效果時，不同檢測時間節(jié)點，反映的情況也不一樣，故最佳檢測時間節(jié)點是評價的關(guān)鍵。目前對于FM檢測時間節(jié)點尚無統(tǒng)一意見，同一患者的連續(xù)檢測可能對疾病的監(jiān)測效果更好。

4 小結(jié)和展望

IBD易反復(fù)發(fā)作、病情遷延，疾病篩查、病程動態(tài)監(jiān)測，極大影響患者的健康和生存質(zhì)量。內(nèi)鏡及病理檢查雖然具有較高的準確度和特異度，但因其有創(chuàng)性、痛苦體驗和費用高，患者依從性較低，大大影響疾病的監(jiān)測。FM檢測標本采集和保存簡便，無創(chuàng)且經(jīng)濟、客觀，在IBD篩查、診斷、評估及隨訪中具有更大優(yōu)勢。IBD的FM包括FC、FL、新喋呤、PKM2、S100A12、MMP-9等，在IBD的診療中有良好的應(yīng)用前景。但迄今尚未發(fā)現(xiàn)其中一種可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的內(nèi)鏡檢查和病理檢查。相信隨著對IBD病因及機制研究的深入，檢驗技術(shù)的進步，將會發(fā)現(xiàn)更多具有高特異度、靈敏度的糞便標志物。