PRKAG2基因突變與心臟的關(guān)系

胡海鷹 張必利 綜述 鄭興 審校

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200033； 2.武警江西總隊(duì)，江西 南昌 330000)

自2000年人遺傳性心肌病相關(guān)基因——PRKAG2基因成功定位后，人們對(duì)于該基因的功能研究不斷深入，該基因的點(diǎn)突變可引起不同程度的臨床表現(xiàn)，引發(fā)了人們的極大興趣，現(xiàn)對(duì)該基因的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 PRKAG2基因概述

PRKAG2基因定位于染色體7q36，包含16個(gè)外顯子，30萬個(gè)堿基，編碼569個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為6.3×104。它編碼腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)γ2亞基，人類心臟組織中以此亞基形式存在。AMPK是細(xì)胞能量感受器，是調(diào)節(jié)細(xì)胞合成和分解代謝信號(hào)途徑中主要的組成成分。AMPK由催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β和γ以異源三聚體的形式存在[1]，各亞基又有多種亞型(α1/α2、β1/β2、γ1/γ2/γ3)，不同組織的AMPK由不同的亞型聚合而成，其中γ亞基正是AMPK感受細(xì)胞能量的感應(yīng)器。

PRKAG2基因包含4個(gè)胱硫醚β-合成酶(CBS)基序，它們串聯(lián)形成Bateman結(jié)構(gòu)域，N-末端接有一延長區(qū)域。翻譯成蛋白后，CBS基序?qū)ΨQ存在，類似扁平的圓盤，理論上可產(chǎn)生4個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)，能結(jié)合核苷酸AMP、ADP或ATP；但其中的CBS2不能結(jié)合核苷酸，可能是因?yàn)槿狈Y(jié)合腺嘌呤核苷酸的天門冬氨酸殘基[2]。

當(dāng)細(xì)胞能量缺乏時(shí)(AMP/ATP比值上升)，AMP結(jié)合到γ2亞基Bateman區(qū)域，誘發(fā)α亞基激酶區(qū)的一個(gè)特異性蘇氨酸殘基Thr172位點(diǎn)磷酸化，從而激活A(yù)MPK，最終開啟分解代謝途徑以生成ATP，并關(guān)閉需消耗ATP的合成代謝途徑，以此來維持能量的動(dòng)態(tài)平衡[3-4]。高濃度的ADP與AMP作用相似，激活A(yù)MPK；而ATP作用相反[5]。Willows等[6]在細(xì)胞水平的研究顯示γ2的N末端區(qū)域也可通過影響Thr172去磷酸化從而調(diào)節(jié)AMPK活性。

2 PRKAG2基因突變與臨床表型

2001年，Gollob等[7]報(bào)道了PRKAG2基因突變與家族性心室預(yù)激(或WPW綜合征)、傳導(dǎo)系統(tǒng)異常及心肌肥厚發(fā)病有關(guān)。隨后相繼發(fā)現(xiàn)多個(gè)家系存在不同的PRKAG2基因突變，并全部或部分出現(xiàn)上述臨床表型。該基因突變主要表現(xiàn)為心臟功能紊亂，典型特征是：心室預(yù)激、進(jìn)展性心臟傳導(dǎo)功能障礙、心肌肥厚以及心肌細(xì)胞糖原過量沉積，被定義為PRKAG2心臟綜合征，屬于代謝性心肌病，少數(shù)患者可出現(xiàn)骨骼肌異常等心臟外病變；確診該病有賴于基因檢測。該病雖類似肥厚型心肌病；但與之不同的是，PRKAG2心臟綜合征無心肌纖維化，無肌節(jié)排列紊亂。PRKAG2心臟綜合征雖然罕見，但經(jīng)家系分析顯示呈常染色體顯性遺傳，故一旦發(fā)生，可累及多名家系成員。目前，國內(nèi)外報(bào)道的PRKAG2基因突變至少有16種，含1種移碼突變Leu351Ins和15種錯(cuò)義突變，分別為：Glyl00Ser、Arg302Gln、Ser333Pro、Val336Ala、His383Arg、Arg384Thr、Thr400Asn、Lys475Glu、Tyr487His、Asn488Ile、Glu506Lys、His530Arg、Arg531Gly、Arg531Gln、Ser548Pro[2,8-16]。不同的突變位點(diǎn)導(dǎo)致的臨床表型輕重不一，而即使是同一突變，家族成員的臨床表現(xiàn)也各有差別。其中Arg531Gly突變可使受累患者在兒童期即出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，而Arg384Thr和Arg531Gln突變甚至可導(dǎo)致患者在出生后數(shù)周內(nèi)死亡，最終只能通過尸檢確定致病原因，是迄今報(bào)道最嚴(yán)重的類型。

3 PRKAG2基因的功能研究現(xiàn)狀

PRKAG2基因突變分布于全身，但僅心臟受累，這可能是因?yàn)槿祟愋募≈兄饕磉_(dá)γ2亞型[17]。該突變是如何引起糖原沉積、心室預(yù)激、心肌肥厚或心臟傳導(dǎo)功能障礙的？人們通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)PRKAG2基因突變得到了初步的認(rèn)識(shí)，近期又有基因敲入(knock-in)小鼠和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)的心肌細(xì)胞水平的研究，拓展了人們對(duì)該基因的功能認(rèn)識(shí)。

在轉(zhuǎn)基因小鼠水平，不同位點(diǎn)PRKAG2基因突變得出的結(jié)論并不一致。Sidhu等[10]研究Arg302Gln突變發(fā)現(xiàn)AMPK活性顯著減少；而Arad等[11]發(fā)現(xiàn)Asn488Ile突變導(dǎo)致AMPK活性增高；Banerjee等[12]則發(fā)現(xiàn)Thr400Asn心肌中AMPK活性存在雙相變化，早期激活，隨后降低，最后恢復(fù)到野生型水平。因此，有學(xué)者提出PRKAG2基因突變導(dǎo)致AMPK活性失調(diào)(抑制或活化)是PRKAG2心臟綜合征的發(fā)病機(jī)制。

Burwinkel等[18]研究表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CCL13中過表達(dá)α1β1γ2異源三聚體后，Arg302Gln、His383Arg、Thr400Asn、Arg531Gly突變可同時(shí)降低AMPK-γ2對(duì)AMP、ATP的親和力，降低程度依次遞增。而在人胚胎腎臟293細(xì)胞中，過表達(dá)Arg531Gly和Arg531Gln突變，雖顯著降低了AMP、ATP的親和力，完全阻斷了AMP異構(gòu)激活A(yù)MPK的作用，仍可增加AMPKα亞基上的Thr172位點(diǎn)磷酸化水平及其活性。

雖然在轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)人γ2突變確實(shí)誘導(dǎo)出了類似人的一些關(guān)鍵疾病特征，且采用相同啟動(dòng)子的野生型γ2小鼠作為對(duì)照進(jìn)行研究，但畢竟γ2是過表達(dá)的，因此被人詬病。為消除過表達(dá)的干擾，近來，研究者建立了三株類似人Arg302Gln、Asn488Ile、Arg531Gly突變的knock-in小鼠模型[19-20]。結(jié)果顯示，所有三株小鼠的肝臟或肌肉組織的AMPK基礎(chǔ)活性增高。Asn488Ile、Arg531Gly knock-in小鼠出現(xiàn)了心室預(yù)激；Arg531Gly小鼠心臟糖原含量大幅增加，心臟重量也是增加的；但Asn488Ile小鼠無此表現(xiàn)。相比之下，Arg302Gln knock-in小鼠無明顯心臟表型。其結(jié)果與之前過表達(dá)突變的研究結(jié)論有差別。

由于Arg531Gly、Arg531Gln和Arg384Thr突變誘發(fā)了該病極嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，這引起了研究者極大興趣，認(rèn)為上述突變對(duì)AMP和ATP結(jié)合γ亞基具有最顯著的影響，對(duì)它們的認(rèn)識(shí)有助于詮釋疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸。研究發(fā)現(xiàn)，Arg531和Arg384分別位于CBS4、CBS2，但也影響AMP或ATP結(jié)合γ亞基關(guān)鍵位點(diǎn)CBS3。Cheung等[13]在Arg531Gly和Arg531Gln突變中發(fā)現(xiàn)，AMP結(jié)合γ亞基減少降低了AMP激活A(yù)MPK的作用，是一種功能喪失效應(yīng)；但ATP結(jié)合減少可增加AMPK活性，是一種功能增益效應(yīng)，且功能增益占優(yōu)勢，正是這種活性增加引起了大多數(shù)病癥；而出現(xiàn)功能喪失效應(yīng)可能是因?yàn)檠芯糠N屬差異引起的，因在嚙齒類動(dòng)物的心臟中主要亞型是γ1。

鑒于在臨床表現(xiàn)最重的Arg531Gln突變細(xì)胞水平研究中發(fā)現(xiàn)AMPK活性是增高的，Salt等[2,18]更傾向于支持γ2突變后引起AMPK活性升高，即功能增益效應(yīng)是PRKAG2心臟綜合征的發(fā)病機(jī)理。這也可以解釋為什么會(huì)出現(xiàn)糖原沉積？AMPK可促進(jìn)心肌攝取葡萄糖，其活性增加可導(dǎo)致葡萄糖攝取增加，這種情況在細(xì)胞并不需要葡萄糖供給時(shí)也會(huì)發(fā)生。在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中過表達(dá)Asn488Ile突變，證實(shí)了這種推測，該模型可誘導(dǎo)出類似人的心室預(yù)激和心肌肥厚[21]。在第50天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的心臟糖原比對(duì)照組增加了20倍，同時(shí)伴有葡萄糖攝取增加和糖原合成增加，而乳酸產(chǎn)物減少，這說明糖原合成增加是由葡萄糖攝取增加所致，而非源自糖酵解。當(dāng)Asn488Ile轉(zhuǎn)基因突變小鼠與攜帶糖原合酶對(duì)葡萄糖-6-磷酸不敏感的突變knock-in小鼠雜交時(shí)，Asn488Ile突變小鼠的高糖原表型及心室預(yù)激均被逆轉(zhuǎn)[22]；但心肌肥厚仍存在，說明前者是繼發(fā)于糖原含量升高，而后者不是。Hinson等[23]在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(iPS-CMs)的研究表明，PRKAG2基因突變通過激活A(yù)KT信號(hào)通路，提高了糖原含量，最終使心肌細(xì)胞增大，與小鼠模型結(jié)論一致。而糖原沉積是葡萄糖代謝調(diào)控的結(jié)果，因轉(zhuǎn)錄水平富含葡萄糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)編碼糖原合酶及其亞型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物升高，且隨著糖原磷酸酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化而改變，后者又與穩(wěn)態(tài)下代謝組學(xué)和葡萄糖代謝動(dòng)力學(xué)的改變相平行。研究還發(fā)現(xiàn)，線粒體生物合成因子如過氧化物酶體增殖物激活受體α和γ輔激活因子1α增加，與線粒體含量升高和呼吸作用增強(qiáng)相符。

糖原含量異常可導(dǎo)致心室預(yù)激。胚胎發(fā)育過程中，心房和心室隨著纖維環(huán)的形成而被分隔，以確保房室腔的唯一電傳導(dǎo)是通過房室結(jié)。在Asn488Ile轉(zhuǎn)基因突變小鼠中發(fā)現(xiàn)[21]，這一纖維環(huán)變薄并斷裂，心肌細(xì)胞內(nèi)的糖原空泡破壞了胚胎發(fā)育過程中纖維環(huán)形成，引起了心房和心室之間的異常電傳導(dǎo)。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)[23]，PRKAG2突變小鼠模型中纖維環(huán)發(fā)生異常形態(tài)改變，其機(jī)制可能為激活的AMPK降低了轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-2β生成，而受TGF-2β信號(hào)通路調(diào)控的纖維環(huán)形成因此出現(xiàn)異常，誘發(fā)心室預(yù)激。

Kim等[22]證實(shí)，通過逆轉(zhuǎn)AMPKγ2 Asn488Ile轉(zhuǎn)基因小鼠的糖原沉積，可消除心室預(yù)激；但仍存在心肌肥厚，表明心肌細(xì)胞增殖不依賴于糖原沉積，有其固有的激活機(jī)制。這一作用可能是通過增加心肌細(xì)胞的胰島素敏感性以及激活A(yù)kt-mTOR-FOXO3A路徑介導(dǎo)的。不同于肥厚型心肌病引起的左室肥厚，PRKAG2心臟綜合征引起的左室肥厚無心肌纖維化的表現(xiàn)，iPS-CMs模型的研究表明這可能是由于TGF-β信號(hào)通路減弱引起[23]，iPS-CMs可表達(dá)豐富的TGF-2β，AMPK參與了TGFβ-2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。此外，在Asn488Ile突變小鼠中發(fā)現(xiàn)雷帕霉素復(fù)合物-1的靶蛋白信號(hào)通路高度激活，正常情況下AMPK抑制這一信號(hào)通路，有研究表明，AMPK可在特定情況下通過提供氨基酸形成自噬而激活雷帕霉素復(fù)合物-1的靶蛋白。當(dāng)Xu等[8]在細(xì)胞水平研究中用雷帕霉素治療Lys475Glu突變，細(xì)胞增殖及肥大被有效逆轉(zhuǎn)；而在Asn488Ile突變小鼠中并不能完全預(yù)防，說明還有其他機(jī)制參與心肌肥厚的發(fā)生。

Wolf等[24]研究Asn488Ile轉(zhuǎn)基因突變小鼠發(fā)現(xiàn)，其體表心電圖顯示PR間期縮短、QRS波變寬。與心肌工作細(xì)胞比較，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞糖原含量更高，易于受到糖原沉積的影響。這也許是臨床上部分患者需安裝起搏器植入治療的原因之一。一項(xiàng)在大鼠心室肌細(xì)胞中過表達(dá)AMPKα1突變的膜片鉗研究[25]顯示，鈉離子通道開放狀態(tài)失活速率減慢，動(dòng)作電位時(shí)程延長。其機(jī)制可能是AMPK通過磷酸化作用調(diào)節(jié)鄰近閏盤的心肌細(xì)胞膜離子通道的密度和功能狀態(tài)來完成。研究者推斷PRKAG2突變的患者也可能受此影響。而其他離子通道如鈣通道是否受突變影響還未知。

此外研究[20]還發(fā)現(xiàn)，在高脂飼養(yǎng)條件下，Arg531Gly knock-in小鼠出現(xiàn)了腎臟功能受損伴糖原沉積，腎囊腫形成、炎癥和細(xì)胞凋亡。Arg302Gln knock-in小鼠純合子隨著周齡增大表現(xiàn)出明顯的肥胖，而雜合子此表現(xiàn)較弱。肥胖可能是因?yàn)樯L素水平升高促進(jìn)了食物攝入，而生長素是通過下丘腦的Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴激酶途徑激活A(yù)MPK進(jìn)行調(diào)節(jié)的。通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴激酶磷酸化Thr172激活A(yù)MPK表明存在一種即使沒有能量需求也能通過升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活A(yù)MPK的機(jī)制[26-27]。總之，這種knock-in小鼠顯示出心臟外表型。有趣的是，在研究了上述小鼠模型后人們也關(guān)注到，人攜帶Arg302Gln突變的雜合子，相比于未受影響的同胞，心臟表型相對(duì)輕，存在非心臟表型特征：如肥胖增加，空腹葡萄糖和糖化血紅蛋白水平增高，胰島素水平降低等。

4 PRKAG2心臟綜合征的治療

除了在傳統(tǒng)的藥物、小分子[28]、起搏器植入、射頻導(dǎo)管消融、心臟移植等對(duì)癥治療層面的探索，近期在轉(zhuǎn)基因和knock-in小鼠的研究中，Xie等[29]通過基因編輯技術(shù)如規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)工具糾正His530Arg突變，其結(jié)果令人振奮：心臟擴(kuò)大、糖原空泡和沉積均被逆轉(zhuǎn)，而心肌肥厚和心功能恢復(fù)至正常水平。這為人們治療顯性遺傳性疾病提供了一種新的手段。

5 小結(jié)和展望

目前人們的研究主要集中于PRKAG2基因突變導(dǎo)致AMPK活性改變的信號(hào)通路，結(jié)合當(dāng)前研究熱點(diǎn)人誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的興起，其結(jié)論將更接近人的病理生理。迄今PRKAG2基因突變電生理的相關(guān)研究較少，對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的研究尚不全面。由于PRKAG2心臟綜合征屬于單基因遺傳疾病，結(jié)合基因編輯技術(shù)，未來有可能治愈該病。

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