骨組織脫鈣方法探討*

方捷迪，王曉星，李爭艷，周 琴，易慕華

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院病理科，湖北宜昌 443001)

骨組織是由黏多糖和一些蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成的骨樣組織和沉著于其中的無機鹽形成的，是一種堅硬的結(jié)締組織，包括細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞隨其發(fā)育階段可分為骨祖細(xì)胞、骨母細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞[1]，細(xì)胞外基質(zhì)包括有機物和無機物，有機物中包括膠原纖維和無定形基質(zhì)，無機物中主要為骨鹽。脫鈣是應(yīng)用化學(xué)或物理化學(xué)的方法將骨組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離，棄去鈣鹽[2]，保留完整有機成分的一種方法。脫鈣方法與脫鈣液的選擇與骨組織切片的制作質(zhì)量有著密切的關(guān)系。骨組織在制片前必須用脫鈣液將組織中的鈣鹽除去，才能制成4～5 μm厚的切片[3]。如果脫鈣不完全，切片時不僅損壞刀刃，而且染色時組織易出現(xiàn)脫片等現(xiàn)象[4]。如果脫鈣過度，會破壞組織結(jié)構(gòu)，使組織抗原丟失，嚴(yán)重影響對送檢標(biāo)本的臨床病理診斷[5]，因此選擇合適的脫鈣方法很有必要。脫鈣液有無機酸(硝酸、鹽酸、硫酸)和有機酸(醋酸、甲酸)兩大類[6]，脫鈣液是決定骨骼組織切片質(zhì)量、染色效果的關(guān)鍵[7]。目前在臨床病理脫鈣中，有3種脫鈣液較理想，本研究通過比較3種脫鈣液的脫鈣效果和染色制片質(zhì)量，旨在選擇一種最好的脫鈣方法應(yīng)用于臨床骨組織脫鈣。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院送檢的骨腫瘤、病變骨及鈣化組織標(biāo)本15例，組織離體后即用10%中性緩沖甲醛溶液充分固定12～24 h。

1.2試劑及儀器 濃鹽酸、硝酸、無水乙醇購自廣東汕頭西隴化工股份有限公司；甲酸、氯仿、蘇木素、伊紅、中性樹膠購自珠海Baso公司；冰醋酸、二甲苯、甲醛購自武漢市中天化工有限公司。常州中威TSJ-QX型全自動封閉式組織脫水機，WB-3000型包埋機，徠卡2235型切片機。

1.3試劑配制 (1)改良Jenkins混合溶液：濃鹽酸5 mL，冰醋酸5 mL，氯仿10 mL，無水乙醇70 mL，10%中性緩沖甲醛10 mL。(2)硝酸-甲醛液：甲醛10 mL，蒸餾水90 mL，純硝酸20 mL。(3)甲酸-甲醛液：甲酸15 mL，甲醛5 mL，蒸餾水80 mL。(4)10%中性緩沖甲醛液的配制：蒸餾水1 000 mL，37%的甲醛溶液100 mL，磷酸二氫鈉4 g，磷酸氫二鈉6.5 g，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7.2～7.4。

1.4方法 (1)固定。組織要求及時充分固定，大塊骨組織應(yīng)鋸開固定，用中性緩沖甲醛液固定時間不少于12～24 h。(2)取材。骨髓穿刺標(biāo)本一般長約1 cm、直徑0.05～0.1 cm，不需修塊，可直接用濾紙包好脫鈣。大塊的骨腫瘤、病變骨、鈣化組織根據(jù)標(biāo)本的不同用骨鉗或骨鋸處理成1.5 cm×1.0 cm×0.2 cm的骨組織塊。(3)脫鈣及終點判斷。①物理方法：隨時觀察脫鈣情況，當(dāng)組織塊呈半透明狀浮在液面上，手指按壓柔軟有彈性，用大頭針可輕松刺入骨皮質(zhì)表示脫鈣完全。②化學(xué)方法：用吸管取脫鈣液1 mL，加10%草酸鉀1 mL搖勻，以草酸鹽結(jié)晶不析出為脫鈣終點。(4)脫鈣后的除酸處理。脫鈣完全后，標(biāo)本用流水沖洗5 min，碳酸鋰飽和水溶液5 min，沖洗3次；再流水沖洗10 min，即可進(jìn)行常規(guī)脫水，染色時適當(dāng)延長組織在蘇木素中的時間，而在伊紅停留的時間適當(dāng)縮短，這樣可以得到更好的對比度。

1.5觀察指標(biāo) 骨組織脫鈣時間、骨組織、HE染色效果。

2 結(jié) 果

經(jīng)上述方法比較得出：骨組織塊經(jīng)改良Jenkins液常溫脫鈣4 d左右脫鈣完全，組織損傷小，常規(guī)制片效果好，切片平坦，薄厚均勻，鏡下見組織結(jié)構(gòu)完整，無皺縮、龜裂現(xiàn)象，細(xì)胞核呈藍(lán)色，骨基質(zhì)、纖維、軟骨呈不同程度的紅色，色澤鮮艷，對比度好。骨組織塊在甲酸-甲醛脫鈣液中72～120 h脫鈣完全，組織損傷較小，切片結(jié)構(gòu)完整，染色鮮艷均勻，對比度較好。骨組織塊在硝酸-甲醛脫鈣液中48～60 h到達(dá)脫鈣終點，肉眼見組織稍發(fā)泡腫脹，顏色淡黃，切片容易出現(xiàn)刀痕；鏡下見組織結(jié)構(gòu)欠完整，胞核淡染著色弱，對比度欠佳。3種脫鈣液脫鈣時間的比較，甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>硝酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液脫鈣效果的比較，硝酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液對組織損傷的比較，硝酸-甲醛脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液。

3 討 論

脫鈣是骨組織制片中的必要環(huán)節(jié)，如若脫鈣不徹底，則組織切片困難，染色時易脫片，鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)模糊，胞核皺縮，部分區(qū)域折疊卷曲，影響病理診斷的及時性和準(zhǔn)確性[8]。尋找簡便、快捷、有效的脫鈣方法是骨組織病理學(xué)研究的重要課題之一。結(jié)合多年骨組織脫鈣經(jīng)驗，筆者認(rèn)為以下方面值得關(guān)注。

3.1骨組織的固定 骨組織及時、充分的固定不僅能保存良好的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且能防止組織自溶腐敗，阻止細(xì)胞內(nèi)外的酶對蛋白質(zhì)的分解作用、保存組織細(xì)胞的抗原性[9]。脫鈣液中的酸對骨組織有不同程度的損傷，未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織大3倍，所以骨組織必須先固定后脫鈣，或脫鈣與固定同時進(jìn)行，未經(jīng)固定的骨組織不宜脫鈣。

3.2脫鈣時應(yīng)權(quán)衡的因素 (1)盡量減少脫鈣液對組織和細(xì)胞成分的損傷，保護(hù)組織微細(xì)結(jié)構(gòu)。(2)能充分去除鈣質(zhì)，又不影響后續(xù)HE和IHC染色。(3)脫鈣方法簡單，試劑價廉易得，適當(dāng)兼顧脫鈣時間[10]。

3.3脫鈣后的中和酸處理 常規(guī)硝酸脫鈣后的組織一般需要流水沖洗10～12 h，費時又不環(huán)保，本文脫鈣到達(dá)終點后先流水沖洗5 min，然后飽和碳酸鋰水溶液處理5 min×3次，再流水沖洗10 min，只需短短30 min即完成整個除酸過程。具有以下優(yōu)點：由于飽和碳酸鋰水溶液是一種弱堿液，能很快滲入到組織細(xì)胞中中和酸，大大縮短了流水洗滌時間，經(jīng)此改進(jìn)除酸方法制成的切片對蘇木素嗜染性強，效果穩(wěn)定。

3.4脫鈣液的選擇 本科室近年來一直采用10%硝酸脫鈣，主要是因為其脫鈣能力強，脫鈣時間短，但這也使骨組織的脫鈣程度較難掌握，容易過脫，對組織造成損傷。硝酸在脫鈣過程中會產(chǎn)生二氧化碳，氣泡從組織中溢出會使結(jié)締組織分離[11]，破壞組織結(jié)構(gòu)。另外，硝酸處理組織后染色效果差，胞核不著色或著色淺，不均勻，對比度欠佳。甲酸又名蟻酸，其脫鈣速度比硝酸慢，破壞組織的程度比硝酸輕，但脫鈣時間稍長，疏松骨片需脫鈣48 h，致密骨片需4～5 d，其中每3 d需更換新液1次[1]。所以迫切需要尋找好的脫鈣方法取而代之。通過查閱文獻(xiàn)，綜合比較文獻(xiàn)介紹的較為理想的3種脫鈣方法，發(fā)現(xiàn)Jenkins復(fù)合脫鈣液棄硝酸而選用鹽酸，對組織損傷小，不會使組織膨脹，而是使組織略有收縮。骨組織塊經(jīng)此液脫鈣后，切片完整，平坦均勻，無返砂現(xiàn)象。不足之處同樣在于組織處理時間過長，脫鈣完全約需要7 d左右。2015年初本科室摸索改良Jenkins原配方，爭取縮短脫鈣時間，實驗中把鹽酸的量由原來的4 mL增加為5 mL，冰醋酸由原來的3 mL也增加為5 mL，無水乙醇由原來的73 mL降為70 mL，氯仿及甲醛劑量不變，經(jīng)過近50例骨組織塊脫鈣觀察，組織處理時間大為縮短，骨密度高的如股骨組織塊常溫下72 h即可徹底脫鈣，骨密度較低的骨松質(zhì)36～48 h也能脫鈣完全，若加急則可以將脫鈣液放入37 ℃恒溫箱中，骨組織塊24 h左右即達(dá)到脫鈣要求。此組合脫鈣液中鹽酸為強酸，增加鹽酸用量旨在加快脫鈣時間，同時又擔(dān)心影響細(xì)胞核的著色，實際操作中觀察發(fā)現(xiàn)，通過改善除酸方式，鹽酸與生理鹽水和氯仿混合后對細(xì)胞核的著色影響甚微，鹽酸除了加快脫鈣速度，還有使組織略收縮的功效，降低了冰醋酸對組織膨脹的影響[12]。由于骨組織的致密性，固定劑的選用要求具有強的穿透力，Jenkins復(fù)合脫鈣液選用中性甲醛，甲醛具有穿透速度快、固定均勻、對組織收縮較小的特點，使得脫鈣液不但具有脫鈣作用，同時兼具較好的固定作用。冰醋酸具有在固定時穿透速度快，且有防止組織自溶變性的特點，同時還能使組織略膨脹，稍加量即可抵消鹽酸及甲醛引起的組織收縮和硬化[13]。骨組織在改良Jenkins液脫鈣徹底后切片光滑細(xì)膩，厚度可達(dá)4 mm，骨與骨周圍組織形態(tài)保持完整，骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞清晰可見，胞質(zhì)、胞核及骨小梁著色均勻，色彩鮮艷，對比度強，能較好地顯示骨組織的各種結(jié)構(gòu)，是一種較理想的用于臨床病理工作的脫鈣方法。

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