蛇毒毒素中影響血小板功能成分的研究進(jìn)展

趙 琦，孔 毅

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物制藥教研室，南京 210009)

蛇毒是蛇毒腺分泌的天然毒素，成分復(fù)雜，含有多種具有不同生物活性的酶和多肽[1]，其能作用于血小板、調(diào)節(jié)血小板聚集反應(yīng)的物質(zhì)。本文從血小板功能的角度出發(fā)，對蛇毒毒素中發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)進(jìn)行綜述。

1 血小板的生理功能

血小板是血液循環(huán)系統(tǒng)中一類非常重要的無核細(xì)胞，其表面有眾多受體，包括 GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ、GPⅥ、5-HT2A、TP、α2A、蛋白酶激活受體(PARs)、P2Y1和P2Y12等。當(dāng)血管發(fā)生損傷時，血小板會從循環(huán)系統(tǒng)被募集到受損暴露的內(nèi)皮下基質(zhì)周圍，von Willebrand factor(vWf)識別作用于血小板表面的糖蛋白受體GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ的GPⅠbα亞基，進(jìn)而使血小板黏附到內(nèi)皮下的膠原組織，其表面受體GPⅠa/Ⅱa和GPⅥ也結(jié)合膠原組織，使黏附更為牢靠[2]。黏附反應(yīng)以及各種誘導(dǎo)劑與血小板表面受體蛋白的結(jié)合反應(yīng)都可激活血小板，使得血小板發(fā)生一系列的響應(yīng)，包括血小板形狀改變以及各種胞質(zhì)內(nèi)含物的分泌?；罨难“濡?致密顆粒分泌的各種產(chǎn)物，如ADP、血清素、血栓烷素A2、腎上腺素、纖維蛋白原、vWf、凝血因子Ⅴ、Ⅺ、和能夠維持并進(jìn)一步擴(kuò)大血小板的初級響應(yīng)，并促進(jìn)更多的血小板被募集。α-致密顆粒還會分泌多種蛋白質(zhì)來參與止血和血管損傷修復(fù)過程，如血小板因子Ⅳ、β血栓球蛋白、肝素拮抗劑(PF4)等。大多血小板受體激活劑都能夠誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+的動員，并通過G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮級聯(lián)作用。整合素αⅡbβ3是血小板聚集過程中的主要受體分子，血小板的激活能夠誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變，使其變成高親和力狀態(tài)。纖維蛋白原、vWf以及其他具有RGD序列的蛋白分子與活化的整合素αⅡbβ3結(jié)合，促進(jìn)血小板的相互作用[3]。vWf和纖維蛋白原的相互作用能夠穩(wěn)定血小板栓塊的形成，進(jìn)而激發(fā)一系列的級聯(lián)信號反應(yīng)最終造成不可逆的血小板聚集現(xiàn)象。

2 蛇毒毒素中影響血小板功能的活性成分

現(xiàn)已從蛇毒毒素中分離出許多具有不同功能的活性物質(zhì)，并發(fā)掘出其藥用價值，如注射用白眉蛇毒血凝酶是臨床上常用的止血類藥物[4]。蛇毒還具有強(qiáng)效的抗栓活性，科學(xué)家從其中提取出了許多新型蛇毒活性多肽，用于抗血栓治療[5]，本文介紹幾種從蛇毒毒素中純化得到的具有影響血小板生理功能的活性物質(zhì)。

2.1磷脂酶A2磷脂酶A2廣泛存在于自然界中，根據(jù)其起源、氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特征、催化機(jī)制、生物化學(xué)特性以及功能差異可分為15個類型。它能特異性作用于生物膜磷脂的甘油骨架sn-2位置，從而催化生物膜磷脂的水解。磷脂酶A2是蛇毒毒素中的重要組成成分，在蛇類捕食和消化中發(fā)揮著重要的作用。蛇毒中的磷脂酶A2屬于Ⅰ和Ⅱ型[6]。

磷脂酶A2具有多樣的毒性和藥理作用，包括神經(jīng)毒性、肌毒性、促溶血、促炎反應(yīng)、抗凝活性、細(xì)胞毒性、殺菌活性以及血小板功能調(diào)控活性等[7]。其中對血小板功能的影響至少包括3類。第一類能夠誘導(dǎo)血小板聚集，如從Bothropsjararacussu和Agkistrodoncontortrix蛇毒中分離出的磷脂酶A2組分；第二類能夠抑制血小板聚集，如從B.moojeni中分離到的BmooTX-Ⅰ、BmooPLA2，從B.jararacussu中分離到的BthA-Ⅰ-PLA2，從B.jararaca中分離到的BJ-PLA2，從B.erythromelas中分離到的BE-Ⅰ-PLA2，以及從B.pauloensis中分離到的BpPLA2-TⅪ；第三類對血小板具有雙重影響，在低濃度或短潛伏時間內(nèi)誘發(fā)聚集，在高濃度或經(jīng)過長時間的潛伏后會產(chǎn)生抑制血小板聚集的作用，例如從Viperarussellii蛇毒中分離到的一種磷脂酶A2組分[8]。磷脂酶A2可以通過各種各樣的作用機(jī)制來影響血小板的聚集功能，可以水解血小板膜表面的膜磷脂生成花生四烯酸以及相應(yīng)的代謝產(chǎn)物如TXA2，從而促進(jìn)血小板聚集反應(yīng)[9-10]；也可以通過裂解花生四烯酸的副產(chǎn)物或其他的催化機(jī)制來抑制血小板的聚集[10-11]。

2.2絲氨酸蛋白酶 蛇毒絲氨酸蛋白酶(SVSPs)是蛇毒毒素中研究非常廣泛的一類組分，在陸生蛇類中最為常見(包括蝰蛇科、響尾蛇科、眼鏡蛇科和游蛇科)，而在海蛇類中少有發(fā)現(xiàn)[12]。蛇毒絲氨酸蛋白酶依靠其高活性的絲氨酸殘基來發(fā)揮催化活性[13]。

蛇毒絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列與胰蛋白酶、激肽釋放酶相似，并且表現(xiàn)出相同的活性中心與相似的催化機(jī)制。由于蛇毒絲氨酸蛋白酶活性中心外的序列存在差異性，導(dǎo)致作用底物的不同，表現(xiàn)出生物活性的差異[14]。一些SVSPs促進(jìn)血小板聚集的活性機(jī)制與凝血酶類似，能夠水解血小板受體表面的PARs受體，尤其是人類血小板表面的PAR1和PAR4。從B.jararaca，B.Atrox中分離得到的SVSPs PA-BJ和血清素thrombocytin組分，都是通過這樣的方式發(fā)揮作用。這些SVSPs能夠激活血小板內(nèi)部的鈣動員，促進(jìn)凝血酶發(fā)揮功能。PA-BJ可以裂解PAR1受體N端區(qū)域的Arg41-Ser42位點(diǎn)，進(jìn)而使Arg46-Asn47肽鍵斷裂，使得配體失活[15]。與之相反，從Cerastescerastes中分離得到的bothrombin[16]則是通過與GPⅠba受體相互作用來激活血小板發(fā)揮功能。

2.3蛇毒金屬蛋白酶 蛇毒金屬蛋白酶(SVMPs)是蛇毒蛋白中的一類重要組成成分，發(fā)揮重要的蛋白水解和生物活性功能，含有Zn2+的蛇毒金屬蛋白酶屬于metzincin家族。它們的一級序列高度一致，Zn2+結(jié)合位點(diǎn)都含有共同的HEXGHXXGXXHD序列。由于氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域的不同，SVMPs可分為P-Ⅰ、P-Ⅱ和P-Ⅲ 3種類型[17]。其中，P-Ⅰ型的相對分子質(zhì)量為20～30 kDa，包括信號肽、前肽和金屬蛋白酶域3個結(jié)構(gòu)域；P-Ⅱ型相對分子質(zhì)量為30～60 kDa，在 P-Ⅰ型3個區(qū)域的基礎(chǔ)上增加了去整合素域，該區(qū)域經(jīng)常被轉(zhuǎn)錄后修飾酶切；P-Ⅲ型相對分子質(zhì)量為60～110 kDa，以類去整合素域代替了去整合素域，且包含1個富半胱氨酸殘基區(qū)域[18]。

SVMPs大多屬于纖維蛋白原溶酶。如從B.lanceolatus中分離得到的BlaH1能水解纖維蛋白原的Aα和Bβ鏈，使纖維蛋白原失活，進(jìn)而抑制血小板的聚集。另一些SVMPs具有1個影響血小板功能的重要區(qū)域類去整合素域。如從B.jararaca毒素中分離到的 P-Ⅲ型 SVMPs可以結(jié)合血小板表面整合素的α2亞基，裂解β1亞基，干擾整合素α2β1活性，從而產(chǎn)生抑制瑞斯西丁素和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集活性[19]。SVMPs還可以通過與血小板表面其他受體相互作用從而發(fā)揮活性。如從Trimeresurusalbolabris分離到的SVMPs組分Alborhagin通過與GPⅥ受體相互作用來激活血小板功能[20]。

2.4去整合素 去整合素是一類富含半胱氨酸殘基的短肽(40～100 aa)，可分為5類：①具有41～51個氨基酸殘基，4對二硫鍵的短鏈去整合素；②具有70個氨基酸殘基，6對二硫鍵的中鏈去整合素；③具有接近84個氨基酸殘基，7對二硫鍵的長鏈去整合素；④從P-Ⅲ型 SVMPs中衍生出的類去整合素域，具有將近100個氨基酸殘基和8對二硫鍵；⑤雙鏈去整合素，包括同雙鏈和異雙鏈整合素2類，每條鏈具有67個氨基酸殘基和10個半胱氨酸殘基，形成4對鏈內(nèi)二硫鍵和2對鏈間二硫鍵[8]。

去整合素都含有1個抑制環(huán)，包含 RGD序列或MLD、MGD、VGD、KGD、WGD RTS以及KTS序列。去整合素能夠通過這些序列與相應(yīng)的整合素結(jié)合來發(fā)揮生理活性，即能夠抑制整合素介導(dǎo)的活性功能。去整合素對血小板聚集的抑制作用可歸功于其對αⅡbβ3整合素的抑制，其含有的RGD序列可與αⅡbβ3整合素相結(jié)合，阻斷纖維蛋白原和其的相互作用，抑制多種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)。整合素RGD序列也可以結(jié)合玻連蛋白受體αⅤβ3，通過阻斷其與內(nèi)皮基質(zhì)細(xì)胞的黏附作用來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，誘發(fā)出血現(xiàn)象。從B.insularis蛇毒中得到的一種RGD去整合素Insularin，就能夠抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集以及內(nèi)皮細(xì)胞和固定化纖維蛋白原的黏附作用[21]。

2.5L-氨基酸氧化酶L-氨基酸氧化酶(LAAO)廣泛存在于真菌、細(xì)菌、動物等各類有機(jī)體內(nèi)，其中蛇毒LAAO研究最為廣泛[22]。蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAOs)是一類典型的核黃素酶，能催化L-氨基酸的氧化脫氨基作用，生成α-酮酸和氨和過氧化氫(H2O2)。SV-LAAOs結(jié)構(gòu)上屬于連接有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔基的同源二聚體糖蛋白，相對分子質(zhì)量為100～150 kDa。由于含有輔基FAD的原因，SV-LAAOs在465 和380 nm處有典型的特殊吸收峰。

蛇毒L-氨基酸氧化酶SV-LAAOs具有多種藥理作用，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、水腫、溶血、出血以及殺菌、抗寄生蟲、抗腫瘤和影響血小板等功能，其中多數(shù)功能活性都與 LAAOs催化反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2有關(guān)。SV-LAAOs既能促進(jìn)血小板的聚集，也能抑制血小板的聚集，作用機(jī)制尚未完全明確，但可以確定和H2O2的生成有關(guān)。從B.pauloensis和C.cerastes毒素中分離到Bp-LAAO[23]和CC-LAAO[24]，這些SV-LAAOs組分可以誘導(dǎo)血小板的聚集功能，可能的機(jī)制是酶催化產(chǎn)生的H2O2可以促進(jìn)TXA2的合成，進(jìn)而誘導(dǎo)血小板的聚集反應(yīng)。 從A.blomhoffiiussurensis和B.leucurus毒素中分離到的ABU-LAO[25]和Bl-LAAO[26]，這些SV-LAAOs組分可以抑制血小板的聚集功能，可能的機(jī)制是酶催化產(chǎn)生的H2O2干擾了GPⅡbⅢa和纖維蛋白原的相互作用。

2.6C型凝集素 C型凝集素是一類被廣泛研究的蛇毒蛋白家族，主要包括2個因素，一是鈣離子依賴(C-型)，二是糖識別(凝集素)結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-recognition domain，CRD)[27]。蛇毒中還有很多與上述結(jié)構(gòu)類似的蛋白，不同之處在于C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(C-type lectin-like domain，CTLD)，即含有不完整或缺失CRD域，且一般情況下不具有鈣離子結(jié)合特性。為避免這類蛋白名字(C-type lectin-like或-related protein)與C-type lectins發(fā)生混淆，將其命名為Snaclecs(Snake venom C-type lectins)，包括2個同源的亞基：α亞基(14～15 kDa)和β亞基(13～14 kDa)。蛇毒毒素中Snaclecs要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于C-type lectins。Snaclecs具有多種生物活性，包括抗凝活性以及影響血小板功能活性。一部分Snaclecs表現(xiàn)抑制血小板聚集的活性，另一部分則表現(xiàn)為激活血小板聚集的活性。Snaclecs可作用于血小板表面眾多的受體蛋白，包括GPⅠb和GPⅥ受體、α2β1整合素以及CLEC-2(C-type lectin-like receptor 2)。一種從Calloselasmarhodostoma毒素中分離的蛋白rhodocytin(aggretin)，可作用于CLEC-2受體，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的血小板激活作用[28-30]。分別從Echismultisquamatus毒素和E.carinatus毒素中分離的蛋白EMS16 Snaclecs，Echicetin能夠通過作用于α2β1和GPⅠb受體來抑制血小板的聚集[31]。從E.sochureki毒素中分離的Sochicetin-A比較特殊，屬于三聚體結(jié)構(gòu)-(αβ)3，能夠和α2β1整合素相互作用，從而抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集[32]。其他Snaclecs，從A.bilineatus毒素中分離到的bilinexin、從Bitisarientans毒素中分離的bitiscetin、從B.jararaca毒素中分離的botrocetin、從T.mucrosquamatus毒素中分離的mucetin、從C.durissusterrificus毒素中分離的convulxin都能夠誘導(dǎo)血小板的聚集[31,33-37]。從T.jerdonii毒素中分離的Jerdonuxin，則是四聚體結(jié)構(gòu)-(αβ)4，通過和GPⅠb相互作用，便顯出誘導(dǎo)血小板的功能[38]。

2.75′-核苷酸酶 5′-核苷酸酶能夠催化核苷酸水解生成核苷和磷酸，能夠降解由不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)致密顆粒釋放的ADP，所產(chǎn)生的腺苷也能發(fā)揮抑制血小板聚集的活性，可能的機(jī)制在于增加了血小板內(nèi)cAMP的含量。cAMP能夠通過減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量來抑制血小板的激活，同時也會抑制細(xì)胞顆粒內(nèi)含物的釋放，從而激活血小板發(fā)生聚集反應(yīng)[39]。

5′-核苷酸酶廣泛存在于毒蛇類群中，從V.lebetina毒素中分離的VL5′NT屬于同源二聚體5′-核苷酸酶，由相對分子質(zhì)量為60 kDa的單體構(gòu)成，能夠抑制膠原和ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集[40]。另一種5′-核苷酸酶是從T.gramineus毒素中分離的，是相對分子質(zhì)量為74 kDa的糖蛋白，能夠抑制ADP、膠原、花生四烯酸和離子載體A-23187誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)[41]。

3 小結(jié)

機(jī)體的止血過程是一個復(fù)雜精密的反應(yīng)過程，需要血小板、血漿蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞和皮下組織等多種組織細(xì)胞的協(xié)調(diào)作用。其中血小板的功能紊亂已成為機(jī)體血栓形成、炎癥反應(yīng)以及動脈粥樣硬化等疾病的關(guān)鍵因素。抗血小板藥物研發(fā)是血栓性疾病治療中的一大關(guān)鍵[42]。目前，臨床上最常用的抗血小板藥物主要是環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林、磷酸二酯酶(ADP)抑制劑氯吡格雷等[43]。但已上市的抗血小板藥物都有出血風(fēng)險高[44]和一些其他不良反應(yīng)，如氯吡格雷抵抗現(xiàn)象[45]。因此，開發(fā)新的低風(fēng)險的抗血小板藥物具有重要的意義。蛇毒中含有相當(dāng)豐富的活性成分物質(zhì)，能夠作用于血小板發(fā)揮功能的各個環(huán)節(jié)，直接或間接地影響止血反應(yīng)。本文調(diào)研了已知的能夠影響血小板聚集功能的蛇毒成分，對其作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)介紹。今后，會有越來越多蛇毒活性成分被深入研究，并運(yùn)用到臨床的血栓疾病診斷與治療當(dāng)中。