繡球花組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展

閆海霞+蔣月喜+鄧杰玲+黃昌艷+何荊洲+卜朝陽??

摘要：【目的】對國內(nèi)繡球花的組織培養(yǎng)研究進(jìn)行了概述，為繡球花的組織培養(yǎng)提供參考。【方法】從外植體的獲得、初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行重點(diǎn)闡述，討論分析目前繡球花組織培養(yǎng)中存在的問題以及今后的研究方向。【結(jié)果】我國的繡球花組織培養(yǎng)研究起步較晚，雖取得了一定進(jìn)展，并逐步建立了一套繡球花快速繁殖的體系，但仍然存在部分問題。【結(jié)論】目前的繡球花組織培養(yǎng)研究仍較欠缺。

關(guān)鍵詞：繡球花；外植體；生根

中圖分類號：S682文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1003-4374（2017）03-0039-05

Abstract：【Objective】It aims to summarize the research of the tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla，and provides reference for its cultivation【Methods】Existing problems in the cultivation of [WTBX]hydrangea macrophylla and the future research directions are elaborated，based on the research progress with the acquisition of explants，primary culture，propagating culture，rooting culture and transplanting【Results】The research on the tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla in China started lateAlthough some progress has been made and a system for the rapid propagation of hydrangea has been established，problems still exist【Conclusion】At present，the research on tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla is still deficient

Key words：[WTBX]hydrangea macrophylla；explant；rooting

繡球花（Hydrangea macrophylla）屬虎耳草科八仙花屬的落葉灌木[1]，別名眾多，如草繡球、陰繡球、八仙花、粉團(tuán)花、紫陽花等，原產(chǎn)日本以及中國四川一帶，現(xiàn)世界現(xiàn)各地均有栽培。半陰、溫暖濕潤的環(huán)境是繡球花的極佳生長環(huán)境，在富含腐殖質(zhì)、濕潤、排水良好的酸性土壤上生長更好。繡球花可入藥，其葉片含有繡球酚和繡球酚8OβD葡萄糖糖苷等成分（Asahina Y，1929）以及甘茶葉素[2]，可見其是具有較高的開發(fā)利用價(jià)值的。此外，其花朵碩大而艷麗，花色豐富，當(dāng)土壤pH為4～6時(shí)花呈藍(lán)色，當(dāng)土壤pH為75以上則呈紅色，因此可作為測定土壤酸堿度的指示植物[3]。繡球花的繁殖方法以扦插為主，但繁殖系數(shù)低，繁殖速度慢，無法滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要，在一定程度上限制了優(yōu)良新品種的快速繁殖以及工廠化生產(chǎn)。組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)大，繁殖速度快，不會因發(fā)生變異而使有利變異性狀喪失，為滿足人們對有利變異的需要提供了可能[4]。國外對于繡球花研究主要集中在歐美、日本，這些國家對繡球花的資源及育種的研究較早，并且培育出了不少的園藝栽培品種，由于缺乏一套適宜的繡球花快繁技術(shù)，并未進(jìn)行大面積推廣。國內(nèi)首次成功報(bào)道了繡球花的離體快繁技術(shù)是在1998年[5]，隨后有關(guān)繡球花的組培研究逐年增多。本文主要綜述國內(nèi)外對繡球花的組織培養(yǎng)研究進(jìn)行，并就現(xiàn)今存在的問題以及今后研究方向提出相應(yīng)建議，旨在為研究繡球花的組織培養(yǎng)技術(shù)，對其育種、良種繁育提供一定的參考。

1外植體的獲得

植株的任何一部分均可作為外植體，在繡球花的組織培養(yǎng)研究中，帶腋芽莖段、莖尖、葉片、葉柄、葉塊是常用的外植體，而種子、根系或花器官為外植體的研究尚未見報(bào)道。繡球花最早使用葉片為外植體的是Sebastian與Hearser[6]。馮潤東等[7]以莖段、葉片和莖尖為外植體，并將莖段分為中部、下部兩種類型，葉片分為成熟葉、嫩葉兩種類型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)：葉片污染率最低，但不易形成愈傷組織，莖尖污染率較高，但可誘導(dǎo)出側(cè)芽。邢合龍等[8]同樣認(rèn)為葉片不易形成愈傷組織更不能形成不定芽，莖尖雖然污染率略高于但死亡率較低，主要是因?yàn)椋呵o尖本身污染程度低，而其他部位除了嫩葉片都與外界接觸時(shí)間較長，葉片雖污染少，但不容易形成愈傷組織，更不能快速形成不定芽，與快速繁殖相悖，所以選用莖尖為外植體。還有研究表明，葉柄是適宜的外植體的，如范小峰等[9]通過比較莖段、葉柄、葉塊的組培研究發(fā)現(xiàn)，莖段、葉柄、葉塊均可作為離體培養(yǎng)的外植體，其中葉柄的誘導(dǎo)效果最好。由上可知，外植體的選擇受植物自身基因型的決定，同時(shí)還受外植體類型、自身狀態(tài)的影響。

外植體的消毒滅菌是組織培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵一步。消毒劑的種類很多，常用的是將75%酒精和01%HgCl2兩者結(jié)合使用，還有采用酒精結(jié)合次氯酸鈉進(jìn)行消毒滅菌的。酒精穿透力極強(qiáng)，可排除材料上的空氣以利于其它消毒劑的進(jìn)入，因此，酒精通常與其他消毒劑結(jié)合使用，并被用作表面消毒的第一步。HgCl2的消毒效果也很好，但滅菌時(shí)間過長對培養(yǎng)物會有毒害作用，從而影響外植體的成活率，HgCl2是有毒物質(zhì)，從環(huán)保的角度來說是不利于環(huán)保的[10]。研究表明繡球花的外植體消毒采用常規(guī)消毒即可達(dá)到很好的效果，區(qū)別在于消毒劑的滅菌時(shí)間長短。雷亞靈[9，10]認(rèn)為最好的消毒方式為70%酒精浸泡30s后再用01%HgCl2消毒10min。唐曉杰等[12]則以70%酒精消毒30-45s后再利用01%HgCl2滅菌7min，效果最好。任叔輝[13]指出：HgCl2、次氯酸鈉及升汞次氯酸鈉組合都能很好的起到滅菌消毒效果，但滅菌時(shí)間過長，會使外植體部分葉片變黃，甚至出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。殷麗青等[14]在進(jìn)行組培研究時(shí)，針對露地栽培植物的器官或組織雜菌多，滅菌困難的情況，采用了一個(gè)較特別的方法：在材料萌芽前，先用硫酸紙將枝條頂端套起，待新枝萌芽后取其莖段用75%乙醇處理30s后，再用飽和漂白粉上清液滅菌15-20min，滅菌效果較好，且避免去了使用HgCl2，此方法低碳環(huán)保。綜上可知，消毒劑的滅菌時(shí)間長短對外植體的污染和成活率影響很大，因此在篩選適宜的滅菌方法時(shí)，要兩者兼顧。

2初代培養(yǎng)

初代培養(yǎng)也稱啟動(dòng)培養(yǎng)，指的是將外植體首次接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的階段，其目的是獲得無菌的材料。經(jīng)過初代培養(yǎng)的外植體可以通過愈傷組織途徑或者不定芽途徑獲得組培苗。愈傷組織途徑又叫間接途徑，指外植體先脫分化為愈傷組織，再由愈傷組織分化形成叢生芽，然后生根形成完整植株。不定芽途徑也叫直接途徑，即指不經(jīng)愈傷組織階段而直接脫分化產(chǎn)生器官。繡球花的組織培養(yǎng)研究采用兩種方法均可進(jìn)行，但以不定芽途徑為主，愈傷組織途徑為輔。

21不定芽途徑的啟動(dòng)培養(yǎng)

繡球花初代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并在MS上添加不同種類和濃度的激素，這類啟動(dòng)培養(yǎng)基有MS+6-BA 05mg/L+IBA 05mg/L[12]、MS+6-BA 30mg/L+NAA 01mg/L[15]、MS+6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L+GA3 10mg/L[16]。也有部分研究的初代培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，在1/2MS上添加不同種類和濃度的激素，如1/2MS+6-BA 01mg/L+NAA 01mg/L是嫩莖側(cè)芽生長的理想培養(yǎng)基[4]。啟動(dòng)培養(yǎng)基中添加的6-BA、NAA、IBA、GA3，其濃度因品種而異。研究表明，6-BA和NAA的濃度配比對莖段的誘導(dǎo)效果不同，高濃度的6-BA會抑制芽的伸長，苗短小瘦弱，而高濃度的NAA也會抑制芽的萌發(fā)，在MS+6-BA 05mg/L+NAA 02mg/L培養(yǎng)基上，芽的啟動(dòng)率高，生長較快，且健壯[17-19]。當(dāng)6-BA濃度大于20mg/L時(shí)，芽的誘導(dǎo)受到抑制作用，而當(dāng)NAA濃度大于05mg/L時(shí)，不定芽基部產(chǎn)生愈傷組織并表現(xiàn)出細(xì)弱的現(xiàn)象，其中在培養(yǎng)基6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L上，芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)972%，是適宜的啟動(dòng)培養(yǎng)基[14]。

22愈傷途徑的愈傷組織誘導(dǎo)及分化

繡球花的啟動(dòng)也可通過另一種方式發(fā)生，即愈傷組織途徑。但愈傷組織的誘導(dǎo)和分化受外植體的遺傳因素及本身的生理生化影響很大，且因植物種類和部位不同而不同，產(chǎn)生這種差異的主要原因是植物體內(nèi)的內(nèi)源細(xì)胞分裂素與生長素的絕對含量和相對比例。

愈傷組織的誘導(dǎo)和分化受激素種類及濃度的影響很大。細(xì)胞分裂素的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織，生長素則有利于愈傷組織的分化，但單一使用某一種生長素并不利于愈傷組織的分化，將細(xì)胞分裂素和生長素合理地配合使用對愈傷組織的分化極為有利。孫曉榮等[20]將絨繡球的莖尖、側(cè)芽或莖段接種到不同的8種培養(yǎng)基上，其中以MS+6-BA 05-10mg/L +IAA 01-02mg/L的分化率最高。范小峰等[9]認(rèn)為適合繡球花愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 10-20mg/L+NAA 005mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)875%，適合愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 20mg/L+NAA 05mg/L。雷亞靈[10]（2008a）經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)：最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 10mg/L+IBA 10mg/L，誘導(dǎo)愈傷率達(dá)92%。最佳愈傷組織增殖培養(yǎng)基為：1/4MS+6-BA 05mg/L+IBA 02mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)92；最佳的愈傷組織分化培養(yǎng)基為：MS+TDZ 01mg/L+IBA 05mg/L，分化率達(dá)48%。韓玉林[21]經(jīng)過相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明：誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L，不定芽分化的培養(yǎng)基為MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L。由上可知，繡球花的愈傷誘導(dǎo)與分化通常采用的細(xì)胞分裂素為6-BA，生長素則以IBA或者NAA為主。

3增殖培養(yǎng)

快繁是指快速繁殖，增殖培養(yǎng)是快繁的決定性因素，影響快繁的主要因子是增殖培養(yǎng)基的選擇，其中包含基本培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基中的激素組合以及濃度配比。增殖培養(yǎng)中不同的激素配比對側(cè)芽的形成效果不同，激素過少不能促進(jìn)側(cè)芽的形成和生長，激素過多會抑制側(cè)芽的形成和生長。增殖培養(yǎng)中的激素組合以細(xì)胞分裂素和生長素為主，常用的組合是6-BA和IBA，如雷亞靈[10，12]以MS+6-BA 05mg/L+IBA 03mg/L和S+6-BA 30mg/L+IBA 01mg/L為適宜的增殖培養(yǎng)基；馮潤東等[7]以MS+6-BA 10mg/L+IBA 012mg/L為理想的增殖培養(yǎng)基；而邢合龍等[8]則以MS+6-BA 10mg/L+IBA 01mg/L為最佳增殖培養(yǎng)基。此外，MS+6-BA 10mg/L+IBA 005mg/L[22]、MS+6-BA 10mg/L+IBA 01mg/L[12]都能夠使繡球花的增殖效果明顯。從上述研究可以得出，增殖培養(yǎng)基中添加6-BA的濃度范圍是05-30mg/L，而IBA的濃度則控制在005-03mg/L之間。6-BA配合IBA并不是唯一的最佳組合配比，很多研究的激素組合是以6-BA和NAA為主。姜巍等[4]研究得出不定芽理想的增殖培養(yǎng)基為1/2MS+BA 05mg/L+NAA 01mg/L；段新玲等[23]經(jīng)篩選，用MS+6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L或MS+6-BA 20mg/L +NAA 02mg/L作為增殖培養(yǎng)基。NAA和6-BA的濃度在一個(gè)合理范圍內(nèi)才有利于增殖的發(fā)生，此時(shí)不定芽數(shù)量多，植株長勢旺盛，苗粗壯，葉色濃綠[15]。NAA和6-BA的濃度不能太高，否則會抑制不定芽的加粗伸長生長，從而使不定芽矮小細(xì)弱呈叢生狀態(tài)。此外，高濃度的NAA會使不定芽過早地生根[7]。細(xì)胞分裂素6-BA配合低濃度的IAA、NAA效果較好，如在MS+6-BA 10mg/L+NAA 02mg/L和MS+6-BA 10mg/L+IAA 01mg/L培養(yǎng)基上，容易形成不定芽，其長勢好，植株健壯[13]，主要原因是在不定芽增殖繼代的培養(yǎng)中隨著6-BA濃度增加，分化率提高，但生長勢減弱，而IAA、NAA在一定范圍內(nèi)對增殖和伸長的影響不顯著，但濃度過高則會對嫩芽的增殖和伸長產(chǎn)生抑制作用。除了上述涉及的激素以外，還有研究涉及了三種不同種類的激素，在以6-BA 和NAA為主的基礎(chǔ)上附加其他激素。如：MS+6-BA 22mg/L+NAA 01mg/L+GA 05mg/L、MS+6-BA 30mg/L+NAA 01mg/L+GA 05mg/L+活性炭10 g/L、MS+6-BA 30mg/L+NAA 02mg/L+GA 05mg/L+活性碳10g/L，這三種培養(yǎng)基都適宜繡球花的增殖培養(yǎng)[15]；王忠武[16]采用MS+6-BA 05mg/L+NAA 004mg/L+腺嘌呤50mg/L作為增殖培養(yǎng)基也獲得了較高的增殖系數(shù)。多數(shù)研究中的各種增殖培養(yǎng)基均添加生長素，而殷麗青[14]在繡球花的增殖培養(yǎng)中，適宜的增殖培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 10mg/L，并未添加生長素，她認(rèn)為生長素對繡球花的啟動(dòng)培養(yǎng)具有一定的促進(jìn)作用，但對增殖影響不明顯，添加生長素還容易使培養(yǎng)物基部生長根毛，從而影響增殖培養(yǎng)的無菌操作。

4生根培養(yǎng)

瓶內(nèi)生根和瓶外生根是組培生根培養(yǎng)的兩種方式，而瓶外生根一般是針對生根困難的物種。繡球花的生根培養(yǎng)以瓶內(nèi)生根的研究占多數(shù)?；九囵B(yǎng)基則大部分以1/2MS為主，極少用到MS。生根培養(yǎng)基中附加不同種類和濃度的植物生長激素可以使生根更容易，常用的有IBA（濃度為02～10mg/L，以02～03mg/L為主）和NAA（濃度為01～03mg/L），少量用到IAA。任叔輝[13]認(rèn)為在1/2MS培養(yǎng)基中添加NAA和IBA都能促進(jìn)根的形成，但隨著濃度的提高，生根率明顯下降，側(cè)根生長明顯降低，而其研究結(jié)果則以1/2 MS+IBA 01mg/L為最佳生根培養(yǎng)基。在范小峰[9]的研究中，同樣是在1/2 MS培養(yǎng)基上添加IBA，添加濃度為05mg/L，在此濃度范圍內(nèi)，生根效果最好，生根最早，根數(shù)多，生根率達(dá)100%，且植株生長粗壯，而當(dāng)IBA改為IAA時(shí)，雖然根較粗壯，但是生根時(shí)間慢，生根率較低，最高達(dá)909%，可見IAA效果不及IBA，若將兩種生長激素配合使用時(shí)，生根率達(dá)100%，根數(shù)也較多，但根細(xì)弱，會影響后期的移栽成活率。韓玉林[21]研究表明4/5MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L有利于組培苗不定根的形成。繡球花瓶外生根的研究近年也有相關(guān)報(bào)道。龔偉等[3]將組培苗扦插于預(yù)先經(jīng)福爾馬林消毒處理好的瓶外生根基質(zhì)珍珠巖∶蛭石=1∶1上，在濕度大于85%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，生根率達(dá)100%。吳華芬等[22]采用與龔偉相同的瓶外生根方法，研究結(jié)果是相一致的。瓶外生根相對于瓶內(nèi)生根而言，由于省去了生根培養(yǎng)這一階段，其培養(yǎng)程序得到了簡化，節(jié)約了生產(chǎn)時(shí)間，同時(shí)也降低生產(chǎn)成本，是工廠規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑之一。

5煉苗移栽

煉苗移栽是組織培養(yǎng)的最后一個(gè)階段，煉苗的常規(guī)做法是：先將組培苗置于室外自然條件下煉苗2～3d，目的是使其適應(yīng)外部的環(huán)境條件，有利于之后的移栽，然后取出洗凈基部培養(yǎng)基，并用一定濃度的殺菌劑進(jìn)行組培苗的殺菌，即可移栽到基質(zhì)上。移栽后的工作主要是環(huán)境溫濕度的控制，以及土壤的水肥管理。

大多數(shù)組培苗的相關(guān)研究主要圍繞移栽基質(zhì)的種類和配比進(jìn)行。所用移栽基質(zhì)的主要成分有河沙、珍珠巖、蛭石、泥炭等。移入河沙中，成活率達(dá)95%[20]。移入珍珠巖∶腐殖土=1∶2，成活率達(dá)80%以上[12]。移栽到珍珠巖∶蛭石=1∶1，成活率為896%（龔偉等，2003）。在珍珠巖∶蛭石=1∶2基質(zhì)上，成活率可達(dá)100%[10]。采用基質(zhì)蛭石∶珍珠巖=1∶1也可保證移栽的成活[16]。采用營養(yǎng)土配方為腐殖土、珍珠巖、有機(jī)肥體積比為3∶2∶1，成活率可達(dá)98%，且長勢良好[9]。姜巍等[4]將組培苗進(jìn)行煉苗后，再分別移栽到6種不同的基質(zhì)，結(jié)果表明爐灰渣、1/2珍珠巖+1/2蛭石兩種基質(zhì)中效果最佳，成活率分別為975%、950%，但從移栽基質(zhì)的來源與試管苗的長勢看，爐灰渣好于1/2珍珠巖+1/2蛭石。

6討論與展望

繡球花用途廣，觀賞價(jià)值高，既可做園林綠化又可做盆花切花，是著名的觀賞花卉。繡球花具有多元化的色彩，這個(gè)特點(diǎn)非常符合我國彩色苗木產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求。我國的繡球花組織培養(yǎng)研究起步較晚，通過多年的努力，現(xiàn)已逐漸取得了一定進(jìn)展，并逐步建立了一套繡球花快速繁殖的體系。目前主要存在以下幾個(gè)問題：外植體的類型比較單一，僅局限于莖葉；不定芽的分化率低，尤其是以葉片為外植體，通過葉片產(chǎn)生愈傷從而誘導(dǎo)分化不定芽的愈傷分化率較低。今后的研究應(yīng)該在多方面開展，例如多以繡球花葉片為外植體的高效再生途徑，為繡球花高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)，以及今后的基因工程選育優(yōu)良園林品種提供技術(shù)參考。

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