液體活檢在膀胱癌中的研究進展

程 亮，李泉林，陳奇?zhèn)?/p>

(1.美國印第安納大學醫(yī)學院病理科；2.美國印第安納大學泌尿外科；3.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116011)

在美國，膀胱癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位于第4位、女性中位于第9位[1]。膀胱癌呈異質(zhì)性表現(xiàn)，但組織學上分為低級別和高級別。大約70%～75%新診斷的膀胱癌是非浸潤性的，這其中超過50%是低級別的[2]。這些腫瘤有大約34%的復發(fā)率，低于15%發(fā)展為浸潤性腫瘤[2]。這與高級別尿路上皮癌形成鮮明對比，高級別尿路上皮癌大約有70%復發(fā)，在1年后有5%患者出現(xiàn)臨床進展。非肌層浸潤性膀胱癌的特點是復發(fā)率較高，5年生存率為90%。與之相反，肌層浸潤性膀胱癌超過50%患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，中位生存期為13～20月。

最近通過二代高通量基因技術，例如TCGA，已經(jīng)確認了一些有意義的分子標記物，包含拷貝數(shù)異常、體細胞突變，mRNA和microRNA表達、DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄剪切位點異常和基因融合[3]。然而，發(fā)現(xiàn)腫瘤基因異常是通過石蠟包埋組織及新鮮冰凍組織，由于腫瘤的異質(zhì)性，因而少量組織活檢可能不能代表侵襲性最強的亞群。近來基于血液和體液(例如:尿液)中的循環(huán)腫瘤細胞、細胞游離核苷酸(細胞游離腫瘤DNA，循環(huán)RNA和外泌體)的液體活檢備受關注。在膀胱癌患者中，腫瘤釋放循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)和細胞游離腫瘤DNA(ctDNA)入血液或者尿液[4]。CTCs是腫瘤細胞從原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶進入血液的，具有無創(chuàng)并且實時監(jiān)測腫瘤的分子變化。ctDNA是由血漿或者尿液中很小片段的DNA形成，其中包含腫瘤特異性基因序列，并且可能作為特異性標記物[5]。從血液和尿液分離和分析腫瘤細胞以及DNA代表著一種新穎的早期無創(chuàng)診斷手段，并且能進一步監(jiān)測復發(fā)以及對尿路上皮癌治療的敏感性反饋。

本文旨在概括和討論現(xiàn)行的液體活檢及其臨床應用，特別是與膀胱癌分子標記物的相關方面研究，從而創(chuàng)造膀胱癌新的診斷方式、預后評估以及個體化精準治療。

1 循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)

CTCs是指從腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶脫離進入到血流中的細胞。它在正常循環(huán)細胞中含量很少，在腫瘤轉(zhuǎn)移患者中大約1×109血細胞含1個循環(huán)腫瘤細胞，因而需要特異性方法去檢測[6]。檢測的第一步是分離CTCs，現(xiàn)在有很多手段，包括過濾法，免疫磁珠法以及微流控芯片法[7]。目前，臨床中分離CTCs最廣泛的方法是免疫磁珠法，通過在磁珠上加載與CTCs抗原對應的特異性抗體來捕獲CTCs。比如在尿路上皮癌細胞中，最常用的陽性篩選CTCs的抗原是上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，一旦被捕獲住，這些細胞將用CK、CD45和DAPI染色。其中EpCAM、CK染色陽性，CD45染色陰性考慮為CTCs[8]。

在臨床中CTCs檢測已經(jīng)在多種膀胱癌中應用，并且與患者生存期及治療應答相關。GAZZANIGA等[9]報道在非肌層浸潤患者中有8/44(18%)被檢測到CTCs，而這些出現(xiàn)CTCs的患者都與高分期以及原位癌有關。GALLAGHER等[10]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移膀胱尿路上皮癌中CTCs相對數(shù)目較低，但是在有2處或者多處轉(zhuǎn)移的患者發(fā)現(xiàn)更多CTCs。ALVA等[11]證實對于進行新輔助化療而后進行根治性膀胱全切的患者，CTCs >10是預后不良(pT1或者更高)的指標。然而，也有反對這些結果的研究，GUZZO等[12]證明CTC并不是膀胱外侵襲和淋巴結陽性的預測指標。大部分相關研究的實驗只占膀胱尿路上皮癌患者的一小部分，因而CTCs的特異性和敏感性還需要大樣本前瞻性實驗來評估。

目前，通過單細胞高通量基因或者蛋白技術檢測CTCs理想的分子標記物是臨床研究熱點。單細胞序列一般分為以下幾步：單細胞分離，核苷酸抽取和純化，序列庫準備，生物信息庫分析。YANG等[13]對59個細胞進行單細胞測序，從3個膀胱癌患者中提取膀胱癌干細胞、膀胱癌非干細胞、膀胱上皮干細胞、膀胱上皮非干細胞。研究發(fā)現(xiàn)了21個膀胱癌關鍵基因突變，包含了5個功能性通路：細胞周期調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，染色體重構，細胞分化和自我更新。單細胞序列可以應用于區(qū)分腫瘤細胞和正常血細胞，并且同時能獲得腫瘤細胞的表達序列。在未來從CTCs單細胞序列中提取的分子序列能夠?qū)颊叩念A后和疾病進展以及治療抵抗等提供信息，并且為直接靶向治療服務。

2 血漿循環(huán)細胞游離腫瘤DNA

所有的細胞，包括正常以及腫瘤細胞，都散發(fā)DNA，被稱為細胞游離DNA(cfDNA)。ctDNA是循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細胞散發(fā)的cfDNA。ctDNA是長度180～200堿基對的DNA片段[14]。ctDNA如何釋放入血的機制目前還不清楚，ctDNA主要來源考慮為細胞凋亡[15]。除此之外，還有活腫瘤細胞釋放入血的小泡(外泌體)，另外，巨噬細胞吞噬壞死腫瘤細胞也可以釋放ctDNA[14]。

ctDNA包含腫瘤特異性基因突變體，因而可能作為獨一無二的基因標簽和標記物。ctDNA相比于腫瘤活檢有很多優(yōu)勢，由于腫瘤異質(zhì)性很大，因而組織活檢只是腫瘤組織一個時間一個部位的“快照”[16]。而ctDNA很可能是來源于腫瘤所有位點，而且有希望更準確地實時從腫瘤間以及腫瘤內(nèi)檢測患者疾病進展。

ctDNA診斷的主要挑戰(zhàn)是從成千上萬的野生型DNA(正常)拷貝中確認和追蹤極少量的突變DNA片段。這些困難可以通過二代測序或者應用突變特異性聚合酶鏈反應(digital polymerase chain reaction,dPCR)(數(shù)碼PCR)來克服。二代測序可以迅速獲得大量基因數(shù)據(jù)但是需要消耗很多時間進行數(shù)據(jù)分析[17]。而數(shù)碼PCR上千個PCR同時進行，每個區(qū)域的評估是個體化實時進行，但是，每個數(shù)碼PCR(dPCR)只針對于一個特異性突變，需要根據(jù)二代測序結果個體化設計。不過如果建立，相比于二代測序，個體化的dPCR序列是高特異性及敏感性、快速、經(jīng)濟的手段。

很多研究關注膀胱癌中ctDNA的應用。BIRKENKAMP-DEMTRODER等[18]回顧性檢測了12個非肌層浸潤性患者的血清和尿液(6個復發(fā)，6個進展)。通過二代測序檢測基因突變，將高腫瘤特異性的基因突變制成個體化適用于dPCR的序列檢測其余患者的血漿及尿液。12個患者中有10個患者檢測到ctDNA(83%)，4/6(67%)ctDNA檢查陽性的患者在幾個月后檢查臨床進展。因而證實這個手段可以用于早期檢測及疾病預后預測。隨后，該實驗室針對膀胱癌患者體液活檢進行FGFR3和PIK3CA突變檢測。這些患者術前(膀胱切除術)術后的樣本均被保留。8/9(89%)可以檢測到ctDNA的患者出現(xiàn)復發(fā)，證實患者血漿中高水平ctDNA與高復發(fā)相關。與二代測序后聯(lián)合個體化序列手段相比，熱點突變序列更快捷和經(jīng)濟。未來臨床上需要更多大樣本的隨機對照試驗來驗證現(xiàn)在的發(fā)現(xiàn)[19]。

GOOTENBERG等[20]聯(lián)合Cas13a酶建立CRISPER為基礎的診斷系統(tǒng)，命名為SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)，這套系統(tǒng)可以在微摩水平檢測單鏈ctDNA。隨著檢測技術的增高，膀胱癌中ctDNA的應用會越發(fā)重要。

3 尿液細胞游離腫瘤DNA

尿液同樣中也發(fā)現(xiàn)ctDNA，可能對部分膀胱癌診斷有效。膀胱癌患者尿液中主要的ctDNA主要來源于腫瘤細胞釋放，并且比血漿中濃度高，因而更容易檢測[21]。

一些研究也關注這個無創(chuàng)的基因檢測手段。KINDE等[22]通過腫瘤特異性序列TERT評估14個早期膀胱癌患者，通過TERT是否陽性預測疾病是否復發(fā)。在和組織病理相符的TERT陽性患者中，7/8(88%)患者復發(fā)，而未測到TERT的患者沒有復發(fā)。DAHMCKE等[23]檢測熱點突變(TERT和FGFR3)以及其余重要的甲基化基因(SALL3，ONECUT2，CCNA1，BCL2，EOMES，VIM)來驗證針對肉眼血尿時是否能替代膀胱鏡檢查。在96/99(97%)尿路上皮癌患者中檢測到腫瘤特異性DNA，在87/376(23%)患者中沒有臨床腫瘤的證據(jù)(敏感性97%，特異性77%，陰性預測率99%，陽性預測率53%)。WARD等[24]最近研究了一種復合PCR和二代測序的技術手段，可以多種基因在一個單獨序列同時間進行檢測。這個技術檢測323個患者6個熱點突變基因(FGFR3，TERT，PIK3CA，TP53，HRAS，RXRA，KDM6A)來評估其可靠性。檢測到86/122(70%)腫瘤患者以及3/109(3%)臨床沒有腫瘤的患者(10%敏感性，97%特異性)。雖然這些領先的研究需要對結果進行大量的分析以及驗證，但還是為膀胱癌尿液ctDNA檢測鋪平了前進的道路。

尿ctDNA也用于膀胱癌預后的評估，BIRKENKAMP-DEMTRODER等[18]基于二代測序設計的個體化陣列檢測101尿液樣本。他們檢測到55/57(97%)臨床進展的患者。反而只有22/44(50%)復發(fā)患者的尿液樣本出現(xiàn)ctDNA。另外，與復發(fā)組相比，臨床進展組ctDNA水平更高。同時，該研究組通過dPCR檢測膀胱癌尿液樣本腫瘤特異性熱點FGFR3和PIK3CA突變。他們發(fā)現(xiàn)非肌層浸潤性尿液ctDNA水平很高，因而能早期檢測疾病進展到非肌層浸潤性膀胱癌。以上結果顯示膀胱癌中尿液ctDNA比血漿更為敏感。

外泌體是(30～100 nm)細胞膜小泡，是細胞外環(huán)境中細胞外小泡的亞群[25]。有幾種方法可以檢測外泌體。比如超速離心，電子顯微鏡觀察或者特異性蛋白標記物CD63、CD9、CD81[26]。它其中的蛋白包含核苷酸，包括DNA、mRNA、miRNA，推斷在和細胞融合時可能調(diào)節(jié)細胞活動[27]。外泌體內(nèi)容物有希望成為腫瘤標記物。從患者身上提取外泌體可以檢測突變、剪切突變、基因融合以及基因表達序列。來源于高表達基因的mRNA可能以很高的濃度在循環(huán)中釋放外泌體。因此，外泌體的分離和分析可能比ctDNA更有優(yōu)勢。外泌體是RNA、DNA穩(wěn)定的載體，而且似乎在腫瘤患者中都呈升高趨勢[28]。

FRANZEN等[29]證實分離肌層浸潤性患者尿液的外泌體能夠誘導尿路上皮細胞上皮間質(zhì)化，為非肌層到肌層浸潤中外泌體的作用提出新的觀點。BERRONDO等[30]發(fā)現(xiàn)通過EDIL3通路，高級別膀胱癌患者尿液提取的外泌體促進尿路上皮細胞遷移和血管生成，也證明了外泌體在腫瘤進展中的作用。

雖然是有希望的腫瘤標記物，但是由于生物樣本的復雜性，與其余細胞外小泡并存以及缺少經(jīng)濟和準確的分離檢測手段，使得外泌體進入臨床應用的腳步放慢?，F(xiàn)行的外泌體分離金標準超速離心費時費力。因而需要發(fā)展更敏感的捕獲外泌體的平臺來幫助尋找膀胱癌特異性miRNA和mRNA標記物。

4 循環(huán)RNA

RNA包含很多種類，包括miRNA，mRNA和長鏈非編碼RNA，以上都已經(jīng)被證實可以作為膀胱癌潛在的標記物[31]。由于對lncRNA缺少mRNA穩(wěn)定性以及相應的深入理解，我們本文只關注循環(huán)miRNA。miRNA是18-24核苷酸長的單鏈非編碼RNA，通過抑制mRNA靶點而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，因而可以調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡以及增殖[32]。miRNA存在于血漿及尿液中，可能與核糖核蛋白復合體連接，或者在細胞外小泡中(外泌體)，以游離循環(huán)miRNA形式被檢測到。值得注意的是，體細胞DNA突變并不能代表腫瘤細胞整個分子變化，腫瘤基因表達譜的改變可能是因為miRNA對表觀遺傳學的影響，而這種改變ctDNA是無法檢測和分析的，因而，miRNA可以提供很有價值的信息，miRNA和實時PCR為基礎的技術用于研究miRNA。

miRNA在血中的組成成分似乎與腫瘤的起源相關。最近有研究顯示一些特異性的miRNA在腫瘤生成中起到重要作用，因而在未來可以被用作膀胱癌診斷、預后評估甚至治療效果評測的標記物[32-34]。RATERT等[35]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制子miR145在膀胱癌中最普遍下調(diào)的miR141和miR-205是膀胱癌是預后不良的標記物。YOSHINO等[36]顯示miR-145、miR-143、miR-125b這些腫瘤抑制子在一些類型的膀胱癌中是下調(diào)的，然而促癌的miR-183、miR-96、miR-17-5p、miR-20a是上調(diào)的。ROSENBERG等[37]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制子miR-29c表達水平在進展性膀胱癌中嚴重下降。一半的低表達miR-29c的非肌層浸潤性膀胱癌隨后進展為肌層浸潤性膀胱癌，然而94%高表達miR-29c的患者卻沒有進展。SASAKI等[38]證實尿miR-146a-5p在膀胱癌患者中升高，而且濃度與腫瘤分級和浸潤深度相關。

miRNA無法在標本中持續(xù)地存在，并且每次檢測的miRNA都不盡相同，這些缺點限制了miRNA在臨床上的應用。未來仍需要多中心系統(tǒng)性的研究來確認目前的研究結果。

5 未來展望及結論

雖然通過CTC、ctDNA、外泌體和miRNA進行膀胱癌分子診斷迅速發(fā)展，但仍需要多中心大樣本試驗來驗證其臨床應用價值。隨著新技術的不斷開發(fā)，我們相信分子診斷會廣泛應用于臨床實踐中，并且成為膀胱癌監(jiān)測、預后評估、治療效果評判的有力工具。