侵襲性真菌感染與宿主免疫應答的評述

宋章永

(西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，四川瀘州 646000)

臨床上隨著抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，艾滋病和糖尿病的發(fā)病率不斷上升，同時念珠菌、曲霉和隱球菌等侵襲性真菌感染的發(fā)病率和病死率呈急劇上升趨勢[1]。侵襲性真菌感染除發(fā)生在免疫力低下者外，免疫功能正常的人群也會發(fā)生侵襲性真菌的感染[2]。侵襲性真菌已成為繼細菌后的第二重要感染源，其感染人體引起的免疫應答和逃避人體免疫應答的機制均較為復雜，目前尚未完全闡明。本文將對侵襲性真菌在人體內引起的免疫應答和逃避免疫機制的主要研究進展進行評述，旨在為診斷和治療侵襲性真菌的發(fā)生提供依據(jù)。

1 侵襲性真菌細胞壁的主要構成

真菌細胞壁在維持真菌固有形態(tài)、細胞新陳代謝、真菌發(fā)育及與宿主免疫細胞互作等方面發(fā)揮著重要功能。由幾丁質、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖等組成的多糖鏈是真菌細胞壁的主要成分。多糖的數(shù)量和性質存在著種屬間和不同生活階段的差異。真菌細胞最外層是無定形的葡聚糖，是重要的宿主識別受體[3]，這些葡聚糖構成帶有支鏈的多聚體，由于結構復雜，目前尚未完全明確。β-甘露糖是真菌特有的糖型，通過N-乙酰葡萄糖胺與蛋白組成甘露聚糖蛋白復合物，可分布于細胞表面的葡聚糖之間，構成甘露聚糖蛋白的表面結構，在維持真菌細胞的完整性、宿主互作的抗原表位和細胞表面受體分子等方面發(fā)揮作用[3-5]，其特異的抗原決定簇是開發(fā)真菌病檢測試劑盒的重要依據(jù)。另一方面，甘露聚糖蛋白也分散于細胞質周圍的間隙內，構成一些處于細胞壁次內層的糖蛋白，是一些酶的基礎。絲狀真菌的殼聚糖或酵母菌的葡聚糖為主組成的不溶性微細纖維構成細胞壁最內層，是真菌防御宿主免疫應答的重要成分[3,6]。

2 固有免疫應答真菌入侵

侵襲性真菌通過粘附、形態(tài)轉換、分泌胞外酶和毒素物質等方式突破人體天然屏障，進入人體體內，或在人體內寄生，當個體免疫力低下或正常菌群失調時，造成侵襲性真菌病[6-9]。人體體內的單核/巨噬細胞、樹突細胞和自然殺傷細胞等是抵抗病原真菌入侵的第一道防線。固有免疫細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)來識別病原體的保守區(qū)域。目前模式識別受體主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)、C型凝集素家族(C-type lectins,CLRs)、NOD 樣受體(nod-like recep?tors,NLRs)、RIG-I樣 受 體 (RIG-I like receptors,RLRs)等。這些PRPs擁有不同的識別配體、信號轉導和亞細胞位置，通過識別不同病原微生物的相關分子模型(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)來激活免疫細胞內的相關信號通路，從而誘導產生促炎性細胞因子、趨化因子、干擾素和共刺激因子等表達，發(fā)揮免疫防御作用[6]。依據(jù)受體蛋白激活信號通路的不同，將這些受體分為兩類：一類是通過核轉錄因子NF-κB(nuclear factor-κB)或干擾素應答因子IRF(interferon regulatory factor)進行轉錄表達的炎性細胞因子；一類是參與形成的炎癥小體。

目前大量研究證實在識別病原真菌β-葡聚糖和甘露糖時CLRs發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞在應對白色念珠菌侵染時，不是TLRs下游接頭分子MyD88蛋白，而是CLRs募集的Syk(spleen tyro?sine kinase)蛋白激酶協(xié)調天然免疫應答[10]。NLRs屬于胞內PRRs，可識別被免疫細胞吞噬的病原體的PAMPs，在半胱天冬酶-8參與形成炎癥小體時，不依賴NLRs而是通過Dectin-1受體途徑來誘導白介素 IL-1β的產生[11]。CLRs包含 Dectin-1、Dectin-2、Mannose receptor、Mincle和DC-SING(dendritic cellspecific intercellular adhension molecule-3-grabbing non-integrin)等多個成員，主要在骨髓和上皮細胞表達。研究證實，Dectin-1和Dectin-2受體作為PRRs感應白色念珠菌酵母或菌絲體感染時發(fā)揮功能，配體一旦結合受體，則可通過Syk來激活轉錄NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki?nase,MAPK)和鈣調磷酸激酶等信號通路，在機體應答免疫平衡、炎癥性反應和應答病原真菌感染方面發(fā)揮重要功能[12]。但兩受體發(fā)揮功能時又有所不同，Dectin-1受體不依賴Ca2+方式識別真菌β-葡聚糖，而Dectin-2受體是依賴Ca2+方式識別真菌α-甘露聚糖，Dectin-1受體激活NF-κB信號通路時是激活NF-κB的全部亞基，而Dectin-2受體是通過活化NF-κB的c-REL亞基來達到激活NF-κB信號通路[11]。

Dectin-3受體(又名MCL，或Clecsf8，或Clec4d)能夠識別真菌細胞壁上的α-甘露糖，在免疫應答白色念珠菌、皮炎芽生菌等病原菌時發(fā)揮重要作用[13]，且與Dectin-2在識別病原真菌α-甘露聚糖發(fā)揮協(xié)同功能[14]。目前已證實CLRs通過成員之間的復雜協(xié)同作用發(fā)揮應答病原菌的感染[15]。但CLRs成員之間的協(xié)同作用機制均尚未研究透徹[12]。同時CLRs也與其他模式受體發(fā)揮協(xié)同功能，如Toll樣受體中的TLR2和TLR4也能夠識別隱球菌的葡萄糖醛酸木甘露聚糖[2,16]，但CLRs與TLRs的協(xié)同作用機制尚未明確。而針對CLRs下游Syk-負調控蛋白E3泛素化連接酶CBLB(casitas B-lineage lymphoma protein b)的免疫調節(jié)應答白色念株菌的功能研究，為增強固有免疫治療感染的侵襲性真菌提供了思路[17-18]。

固有免疫細胞通過巨噬細胞的吞噬作用，或者分泌一系列細胞因子和趨化因子引起炎癥反應將病原菌殺滅，招募中性粒細胞在感染部位聚集并釋放有效的顆粒物質，達到清除入侵病原菌的目的[19]。不同細胞因子可誘導巨噬細胞極化成M1和M2型，其中M1型巨噬細胞通過產生ROS(reactive oxygenspecies)和 RNS(reactive nitrogen species)來阻礙病原菌的侵染[3,20]，而M2型巨噬細胞在抑制和調節(jié)炎癥反應和傷口愈合方面發(fā)揮關鍵作用。巨噬細胞應答新生隱球菌產生的極化過程較復雜，其機制尚未研究透徹[2]。

3 適應性免疫應答真菌入侵

當侵襲性真菌感染進一步發(fā)展時，人體會啟動適應性免疫來參與防御感染?？乖岢始毎?APC)將抗原提呈給T細胞進而啟動適應性免疫應答。研究已證實CD4+和CD8+T細胞均參與抗病原真菌侵染的反應[2,6]，但CD4+T細胞作用更重要。CD4+T細胞接受抗原刺激后，活化、增殖、分化成輔助性T細胞(helper T cell,Th細胞)。Th細胞受局部微環(huán)境中的細胞因子影響，又可分化為Th1、Th2、Th17或調節(jié)性T細胞(regulatory cells,Tregs細胞)。Th1細胞是應答病原真菌的重要免疫細胞，直接或間接分泌γ-干擾素和IL-2、IL-6、IL-12等白細胞介素，促進巨噬細胞、自然殺傷細胞和CD8+T細胞等的活化和增殖，導致炎癥的發(fā)生和對病原真菌吞噬、滅殺，達到消除感染的病原真菌目地[20-21]。Th2細胞和Th17細胞是應答黏膜念珠菌病所必需的[22-23]，Th2細胞分泌的IL-4、IL-10等白細胞介素因子，可促進B細胞增殖并產生抗體，參與體液免疫應答。同時Th2細胞還分泌白細胞介素IL-13和轉化生長因子TGF-β等，在調控免疫平衡方面發(fā)揮功能，如IL-13可抑制IFN-γ干擾素對巨噬細胞的活化，TGF-β在抑制中性粒細胞活化增殖方面發(fā)揮作用。Th17細胞被證實在病原真菌感染過程中可能發(fā)揮更重要的作用，但其作用機制仍需深入研究[23]。Tregs細胞在機體免疫耐受及維持自身穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要功能，其抗病原微生物感染方面發(fā)揮著功能，但作用機制尚未研究透徹[2,24]。

抗原刺激后，在輔助性T細胞輔助下B細胞活化、增殖、分化為B2細胞，并形成生發(fā)中心和產生特異性抗體，介導體液免疫應答。同時分泌IL-10、IL-12、和IL-13等白細胞介素因子，參與免疫調節(jié)和炎癥反應[25]。

4 侵襲性真菌的逃避免疫機制

侵襲性真菌突破人體天然屏障，會遭遇上述的人體固有免疫和適應性免疫應答。侵襲性真菌采用多種策略來應對相應的免疫環(huán)境：①通過自身形態(tài)的改變來逃避免疫細胞識別，如感染過程中白色念珠菌的酵母-菌絲轉換、white-opaque形態(tài)轉換、新生隱球菌的莢膜增厚和細胞的增大[2,7,26]，均是病原真菌逃避免疫PRRs受體識別的有效手段。②通過改變自身的形態(tài)影響免疫細胞釋放不同細胞因子或干擾素，造成干擾后續(xù)的免疫應答過程[2,27]。③通過表達大量基因改變自身的細胞壁結構，來抑制吞噬小體的成熟，甚至誘導吞噬細胞的程序性死亡[28-29]。④病原真菌通過釋放造成組織損傷的酶或毒素來破壞入侵組織，造成人體的感染[9]?？傊?，病原真菌通過多種策略來逃避人體的免疫應答，從而達到在人體內寄存或感染的目的，但其逃避人體免疫應答的機制較為復雜，目前尚未研究透徹。

5 應用組學技術在侵襲性真菌與人體宿主互作方面的研究

侵襲性真菌與人體免疫細胞的互作是一個復雜而又系統(tǒng)的過程，目前尚未研究透徹。發(fā)揮優(yōu)勢的組學技術和高級系統(tǒng)生物學工具則有助于揭示病原真菌侵染時病原與宿主之間的精確互作模式[30]。現(xiàn)今開展多個水平的組學(轉錄組學、基因組學、蛋白組學、代謝組學和計算機系統(tǒng)生物學)研究可實現(xiàn)多個角度對宿主免疫應答病原真菌入侵的認識。比較轉錄組研究樹突細胞免疫應答細菌和白色念珠菌感染時，共發(fā)現(xiàn)101個差異表達的基因[31]。對白色念珠菌刺激巨噬細胞分化的蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)細胞骨架重排和代謝途徑蛋白在M1型巨噬細胞中上調表達，且發(fā)現(xiàn)白色念珠菌能誘導M1型向M2型巨噬細胞極化[32]。通過基因組水平研究白色念珠菌應答巨噬細胞吞噬時，共發(fā)現(xiàn)102個負調控和872個正調控形態(tài)發(fā)生的基因，且發(fā)現(xiàn)應答巨噬細胞炎性小體時，白色念珠菌通過細胞壁結構的改變和糖基化蛋白的暴露來誘導巨噬細胞的程序性死亡[26]。目前對免疫細胞與念珠菌互作的組學研究比較多，但對免疫細胞應答其它侵襲性真菌的組學研究較少[30,33-34]。同時免疫細胞在應答病原真菌入侵時存在細胞異質性，但免疫細胞應答病原真菌的異質性研究目前尚未見報道。

MicroRNA(miRNA)通過抑制信使RNA的翻譯在免疫細胞分化、發(fā)育和功能調節(jié)中發(fā)揮重要功能，同時在固有免疫和適應性免疫細胞應答病原微生物方面發(fā)揮作用。新生隱球菌誘導單核巨噬細胞后的差異表達miRNA研究顯示：多個差異表達的靶基因集中在T細胞信號通路、胞內因子互作、Toll樣受體調節(jié)等方面[35]。人體樹突狀細胞對白色念珠菌和煙曲霉免疫應答研究發(fā)現(xiàn)共有26個差異表達miRNAs和5個特異表達miRNAs[36]。挖掘病原菌感染誘導不同免疫細胞的miRNA類型及miRNA調控靶基因表達的分子機制，可為治療侵襲性真菌病提供未來治療的靶標。

6 結語與展望

目前侵襲性真菌感染的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，且病死率居高不下，故尋找侵襲性真菌的快速診斷及治療上的突破對臨床治療具有重要意義。侵襲性真菌感染人體宿主，引起機體的固有免疫和適應性免疫應答達到消除感染的病原菌，并維持機體免疫平衡，或者病原菌逃避宿主的免疫應答并造成侵襲性真菌病，其過程均是復雜的。因此侵襲性真菌感染人體引起的免疫應答機制和逃避免疫應答的機制仍需深入研究，尋求更有效的疾病干預靶點，進而從免疫角度為臨床治療侵襲性真菌病提供支持。

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