EB病毒對結(jié)核感染T細胞試驗檢測的影響

汪林嬌　劉子杰　趙瀅

[摘要]目的探討EB病毒感染對結(jié)核感染T細胞試驗的影響。方法選取2015年1～12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疑似結(jié)核感染的患者246例，采集外周血同時進行結(jié)核感染T細胞試驗和EB病毒核酸檢測，分析結(jié)核感染T細胞試驗的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比。結(jié)果結(jié)核感染T細胞試驗的靈敏度為83.87%，特異性為93.49%，準確度為92.27%，陽性預(yù)測值為65%、陰性預(yù)測值為97.57%，陽性似然比為12.88，陰性似然比0.17，約登指數(shù)為0.77。EB病毒再激活與結(jié)核感染性T細胞斑點試驗間有顯著性差異（P=0.021<0.05）。結(jié)論結(jié)核感染T細胞試驗對結(jié)核感染的診斷特異性較高，具有較好的臨床應(yīng)用性能，EB病毒再激活會影響結(jié)核感染T細胞試驗。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核；結(jié)核感染T細胞試驗；EB病毒；γ干擾素

[中圖分類號]R446.6 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-168-04

我國是結(jié)核病高發(fā)國家之一，據(jù)2010年全國結(jié)核病流行病學(xué)估算，全國≥15歲人口中活動性肺結(jié)核患者高達499萬，盡管活動性肺結(jié)核的患病率有所下降，但由于人口數(shù)量增加，實際患肺結(jié)核的人數(shù)較2000年反而有所增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，結(jié)核病診斷率僅為37%，結(jié)核病診斷率低的主要原因是很難找到病原學(xué)證據(jù)，即使在發(fā)達國家結(jié)核病的診斷也僅有50%具有細菌學(xué)證據(jù)支持。因此，尋求一個敏感度及特異度均較高的非病原學(xué)檢測方法具有重要的臨床意義。結(jié)核感染T細胞試驗（T-SPOT.TB）是（ELISPOT）檢測結(jié)核感染的新方法，該試驗是以結(jié)核桿菌特異性抗原刺激T細胞，如果患者感染過結(jié)核桿菌則會釋放γ干擾素，從而可以通過ELISPOT技術(shù)進行檢測。T-SPOT.TB試驗的檢測主要通過抗原刺激記憶性T細胞釋放γ干擾素，因此影響γ干擾素釋放的因素可能會對檢驗結(jié)果產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)EB病毒能抑制干擾素的生成，EB病毒的一種蛋白具有類似ILl0的功能，它能抑制IFN-γ的合成和CD8+細胞毒性T細胞反應(yīng)，因此EB病毒感染可能會對結(jié)核感染T細胞試驗造成影響，本文擬分析結(jié)核感染T細胞試驗的臨床性能并評價EB病毒感染對此實驗檢測結(jié)果的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1～12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院疑似結(jié)核患者267例，收集每位患者臨床資料以及既往結(jié)核病史、結(jié)核接觸史、以及其他疾病和治療史。根據(jù)肺結(jié)核診斷和治療指南，根據(jù)臨床資料確診結(jié)核患者31例，其中男性18例，女性13例，年齡中位數(shù)32.5歲。排除結(jié)核病人215例，其中男性131例，女性84例，年齡中位數(shù)37歲。EB病毒感染組，EB-DNA≥400拷貝/mL12例，其中9例確診結(jié)核。

1.2T-SPOT.TB檢測方法

采用T-SPOT.TB試劑盒（英國牛津），根據(jù)說明書進行操作。

1.3 EB-DNA定量檢測

熒光定量PCR儀購自美國ABI公司（ABI-7300），全血DNA基因提取試劑購自天隆科技公司，EB-DNA定量檢測試劑購自湖南圣湘科技有限公司。DNA提取和擴增均按廠家試劑說明書進行。

1.4 ELISA法檢測抗-EA IgG

用德國IBL公司的成套試劑盒，按說明書操作，測定的吸光度，抗-EA IgG的吸光度值>0.5為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

計算靈敏度、特異性、準確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、陰性似然比采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用x²檢驗，當(dāng)觀察例數(shù)小于4例時采用Fisher精確概率計算，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1T-SPOT.TB試驗的臨床性能評價

結(jié)果表明T-SPOT.TB試驗的靈敏度為83.87%，特異性為93.49%，準確度為92.27%，陽性預(yù)測值為65%、陰性預(yù)測值為97.57%，陽性似然比為12.88，陰性似然比0.17，約登指數(shù)為0.77。見表1。

2.2EB病毒載量對T-SPOT.TB試驗的影響

EB病毒感染組和非感染組間T-SPOT檢測結(jié)果間無顯著影響（P=0.697）。見表2。以抗-EA為EB病毒再激活的標記，結(jié)果表明EB病毒再激活與T-SPOT檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3討論

人體初次感染結(jié)核分枝桿菌后，外周血中的T細胞發(fā)生致敏轉(zhuǎn)化，形成記憶性T淋巴細巴細胞，當(dāng)再次接觸結(jié)核分枝桿菌時，記憶性T淋巴細胞能夠迅速活化增殖，從而引起γ干擾素釋放。T-SPOT.TB法即是基于以上原理，以ESAT-6（Rv3875）和CFP-10（Rv3874）肽段庫作為刺激原，檢測外周血中具有促進γ干擾素釋放的T淋巴細胞，從而反映是否感染過結(jié)核分枝桿菌。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB對肺結(jié)核診斷的敏感度為80%～90%，特異性大于90%，對于肺外結(jié)核診斷靈敏度可達83%～91.7%，特異度可達76.5%～85%。多項研究結(jié)果表明，T.SPOT.TB診斷結(jié)核病具有較高的敏感度和特異度。Pai等對免疫力正常的726例研究對象進行分析，結(jié)果表明T-SPOT.TB的綜合敏感性為90%本文研究結(jié)果表明T-SPOT.TB試驗的靈敏度為80.95%，特異性為93.49%，陽性似然比為12.4，陰性似然比0.2，約登指數(shù)為0.74，與之前研究報道的結(jié)果一致。陽性似然比是檢驗結(jié)果的真陽性率與假陽性率之比，說明試驗正確判斷陽性的可能性是錯誤判斷陽性可能性的倍數(shù)，比值越大，試驗結(jié)果陽性時為真陽性的概率越大。因此，本文所得結(jié)果表明該試驗具有較好的區(qū)分患者與非患者的能力。靈敏度和特異性是一對矛盾對立體，它與診斷閾值有關(guān)，而在臨床工作中最關(guān)注的是該檢驗結(jié)果的陽性或陰性的價值，是否能診斷或排除某疾病，因此陽性和陰性預(yù)測值顯得比較重要，據(jù)報道云南的結(jié)核發(fā)病率約為52/10萬，因此如果一個普通的患者得到陽性結(jié)果時，該方法的陽性預(yù)測值為0.07%，而陰性預(yù)測值可達99.999%，這說明對于普通人群該方法具有很高的排除價值，而診斷價值較小，而在醫(yī)院就診的患者，其結(jié)核的發(fā)病率顯著高于普通人群，本文的研究對象均具有結(jié)核病相應(yīng)體征或影象學(xué)表現(xiàn)，該人群中結(jié)核患病率為15.7%，陽性預(yù)測值為69.8%，陰性預(yù)測值為98.7%，由此可見，當(dāng)待檢人群的患者率升高時其陽性預(yù)測值可顯著升高，因此若將此方法與指南中診斷標準中的一條或幾條聯(lián)合應(yīng)用，如典型的肺結(jié)核臨床癥狀和胸部x線表現(xiàn)、抗結(jié)核治療有效、肺外組織病理證實結(jié)核病變等則可顯著提高該方法的陽性預(yù)測值。此外，本文結(jié)果也顯示該方法具有較高的陰性預(yù)測值，采用此方法排外肺結(jié)核具有重要價值。

當(dāng)前全球有1/3的人感染結(jié)核，每年新發(fā)病例約800萬，結(jié)核仍是全世界導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的疾病。目前針對結(jié)核的病原學(xué)診斷主要依靠抗酸染色和分離培養(yǎng)，分離培養(yǎng)是臨床診斷結(jié)核感染的主要依據(jù)之一，但分離培養(yǎng)時間長，檢出率相對較低，不利于結(jié)核病的早期診斷與治療。基于PCR的擴增方法靈敏度和特異性較高，但因標本原因?qū)е聶z出率仍不理想，血清學(xué)結(jié)核抗體檢測操作相對方便、快速，可作為輔助診斷的方法，但缺乏特異性和敏感性。T-SPOT.TB試驗采用結(jié)核桿菌特異性抗原進行檢測，可避免卡介苗所引起的交叉反應(yīng)，可較好解決疫苗接種所帶來的影響，該方法具有較高的敏感性和特異性。此外，該方法采用血液標本進行檢測，避免了標本采集的影響，有利于臨床操作與保證結(jié)果的一致性。

T-SPOT.TB試驗的最終檢測物為γ干擾素，因此影響γ干擾素釋放的因素可能會對檢驗結(jié)果產(chǎn)生影響。因此高載量的EB病毒可能會干擾IFN-γ的生成與釋放。而本文的結(jié)果表明以400拷貝/mL為cutoff值進行分析，EB病毒對T-SPOT.TB檢測無顯著影響?？赡艽嬖谝韵聨追矫嬖?，首先，本文中研究對象偏少，可能對結(jié)果有影響，下一步工作中應(yīng)擴大樣本量進行分析，其次EB病毒為人群感染率較高的病毒，以400拷貝/mL為閾值進行判斷，則只要感染過該病毒的患者均可能為陽性，而在潛伏狀態(tài)下可能對γ干擾素釋放沒有影響。為研究EB病毒是否在再激活狀態(tài)下對γ干擾素釋放產(chǎn)生影響，文獻報道抗-EA抗體可作為EB病毒再激活的標記。我們采用抗-EA抗體作為再激活的標志，結(jié)果表明抗-EA與結(jié)核感染性T細胞檢測結(jié)果間有顯著性的差異，因此結(jié)果表明EB病毒在再激活狀態(tài)下可能會對結(jié)核感染性T細胞實驗造成影響，但有文獻報道EB病毒主要是對CD8+的細胞干擾素生成產(chǎn)生影響，是否對記憶型T細胞干擾素的生成有影響尚需進一步研究，同時本研究研究病例相對較少，如果擴大樣本量可能會更能證實本實驗結(jié)果；此外，雖然我們發(fā)現(xiàn)抗EA陽性與陰性組與結(jié)核感染性T細胞實驗間存在顯著差異，但沒有直接證據(jù)表明此是因為EB病毒再激活而造成的，但是否更高的病毒載量對T-SPOT.TB試驗有影響有待擴大樣本量進行進一步的研究。

（收稿日期：2017-06-21）