酵母發(fā)酵結(jié)合酶法純化石莼功能性低聚糖

李燕妹, 呂 峰, 許雅楠, 湯陳鵬

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

石莼(Ulvalactuca)是我國極為豐富的野生藻類資源，含有豐富的碳水化合物、粗纖維、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，并含有多種活性成分，如多糖、多肽、低聚糖和揮發(fā)性成分等，是一種價廉物美的海洋生物資源；但大量的石莼漂浮聚集到岸邊，會腐爛發(fā)臭、阻塞航道、污染環(huán)境，嚴(yán)重威脅沿海漁業(yè)和旅游業(yè)的發(fā)展[1].福建沿海的石莼野生資源豐富、質(zhì)量上乘，可開發(fā)利用的潛力巨大.對此，高效提取利用石莼中的生物活性成分，對其進(jìn)行綜合開發(fā)利用，實現(xiàn)石莼高值化利用.

功能性低聚糖是一類介于單糖與多糖之間的低分子量的糖類聚合物.已有研究表明，功能性低聚糖具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖，提高機(jī)體免疫力，降血糖，降血脂，促進(jìn)鈣、鎂、鐵等礦物質(zhì)吸收等生理調(diào)節(jié)功能[2].然而，通常提取得到的功能性低聚糖還存在部分葡萄糖和蔗糖等非功能性糖及被糖包被或與糖結(jié)合牢固的結(jié)合蛋白，這些產(chǎn)物的存在不僅可能影響其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)表征和生物活性，亦可能導(dǎo)致其藥理作用的下降[3].因此，盡可能多地去除游離單糖和二糖等與糖結(jié)合蛋白成為純化功能性低聚糖的一個重要環(huán)節(jié).

功能性低聚糖的純化方法較多，有柱色譜法、膜分離法、酶法和微生物發(fā)酵法.目前對其純化多采用單一的方法，且集中在柱色譜法[4-5]或膜分離法[6-8].但柱色譜法和膜分離法耗時長、設(shè)備投資高.微生物發(fā)酵法是一種綜合效益好，具有良好發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的純化方法，其利用酵母在生長和發(fā)酵的過程中不能利用功能性低聚糖，但能利用游離的單糖和二糖等，以除去小分子非功能性糖類.該法功能性低聚糖損失小、操作簡單、分離徹底，且不需要添加任何試劑，發(fā)酵產(chǎn)物不需要進(jìn)行后續(xù)處理即可直接利用[9-10].酶法脫蛋白，避免了傳統(tǒng)化學(xué)脫蛋白方法的弊病，不僅高效，而且有利于保持功能性低聚糖的活性[11].目前關(guān)于微生物發(fā)酵法結(jié)合酶法純化功能性低聚糖的研究尚未見報道.本試驗將微生物發(fā)酵法與酶法結(jié)合起來，脫除游離糖和蛋白質(zhì)以純化功能性低聚糖，此方法不僅操作簡便、成本低、高效，而且有利于保持功能性低聚糖的活性，是一種良好的純化功能性低聚糖的方法.

本試驗基于篩選的理想蛋白酶和酵母菌株，采用酵母發(fā)酵結(jié)合酶法純化功能性低聚糖，以蛋白脫除率、低聚糖保留率和低聚糖含量為衡量指標(biāo)，采用5因素5水平均勻試驗設(shè)計方案優(yōu)化酵母發(fā)酵結(jié)合酶法純化石莼功能性低聚糖粗品的關(guān)鍵工藝參數(shù)，旨在為進(jìn)一步研究石莼功能性低聚糖的生物活性做前期準(zhǔn)備工作.

1 材料與方法

1.1 材料

酸性蛋白酶(比活力：10萬U·g-1)：購于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；高活性釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，屬酵母目酵母科釀酒酵母屬)干粉：購于湖北安琪酵母股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、檸檬酸、碳酸氫鈉、牛血清蛋白、苯酚、濃硫酸、氯化鈉和葡萄糖等試劑均為分析純.

主要儀器與設(shè)備有UV-1800 PC紫外可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、PL202-S100型精密分析天平[丹麥儀器(北京)有限公司]、HWS 26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、STARTER 3C pH計[奧豪斯儀器(上海)有限公司]、DL-5-B型低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、ZHWY-2102 C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)、SW-CJ-2 FD潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、Nikon eclipse e100顯微鏡[尼康(中國)有限公司]和LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠).

1.2 石莼功能性低聚糖粗品純化的工藝流程

↓接種

1.3 石莼功能性低聚糖粗品純化的工藝要點

(1)石莼功能性低聚糖粗品：石莼可溶性糖粗提液真空濃縮(真空度0.095 MPa、溫度55 ℃)至體積的10%～15%，以4倍體積的比例加入無水乙醇，冰箱靜置24 h后沉淀去除多糖，收集上清液，真空濃縮并去除乙醇，冷凍干燥制得(其成分以糖類為主，帶有一些蛋白質(zhì)).

(2)石莼功能性低聚糖粗品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的石莼功能性低聚糖粗品粉末，按一定比例加入蒸餾水，制成含量為(5.00±0.04)%的石莼功能性低聚糖粗品溶液.

(3)酵母活化：安琪高活性干酵母用高壓滅菌過的1%葡萄糖溶液于37 ℃下活化30 min，并調(diào)節(jié)酵母菌濃度為1.0×108個·mL-1.

(4)發(fā)酵：將石莼功能性低聚糖粗品溶液與酵母活化液按一定比例混合均勻后，在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)酵直至低聚糖含量不再下降時終止發(fā)酵.供試酵母發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母添加量2%～10%、時間1.0～5.0 h、溫度24～32 ℃、搖床轉(zhuǎn)速50～250 r·min-1.

(5)100 ℃殺菌、離心：發(fā)酵結(jié)束后，石莼功能性低聚糖粗品發(fā)酵液于100 ℃殺菌15 min，以殺死酵母菌；并于4 000×g離心力下離心10 min，收集上清液.

(6)酶解脫蛋白：蛋白脫除效果因蛋白酶的種類及酶解條件的不同而不同.在篩選確定目標(biāo)蛋白酶后，用檸檬酸調(diào)節(jié)石莼功能性低聚糖粗品溶液的pH達(dá)到理想范圍，并在一定溫度下恒溫酶解，期間不斷攪拌，以促進(jìn)酶解.酶解工藝參數(shù)為：溫度35～55 ℃、pH 2.5～6.5、時間1.0～3.0 h.

(7)滅酶、冷卻、離心：酶解結(jié)束，石莼功能性低聚糖酶解液沸水浴10 min，鈍化酶活性，冷卻至室溫后，于4 000×g離心力下離心10 min，收集上清液.

(8)真空濃縮、冷凍干燥：將上清液真空濃縮(真空度0.095 MPa、溫度55 ℃)到一定體積，冷凍干燥即得石莼功能性低聚糖樣品.

1.4 酵母發(fā)酵結(jié)合酶法純化石莼功能性低聚糖關(guān)鍵工藝的優(yōu)化

表均勻設(shè)計試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of (108) uniform design

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 蛋白質(zhì)含量和蛋白脫除率的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[12]測定蛋白質(zhì)含量.以蛋白質(zhì)質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，光密度(D)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.所得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

y=0.006 6x+0.018 1(R2=0.997 1)

(1)

蛋白質(zhì)質(zhì)量/mg=(m×V1)/(V2×M×106)

(2)

蛋白脫除率/%=(C1-C2)/C1×100

(3)

(2)和(3)式中：m—蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg);V1—提取液體積(mL);V2—吸取樣液體積(mL);M—樣品質(zhì)量(g);C1—處理前樣液蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg);C2—處理后樣液蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg).

1.5.2 石莼功能性低聚糖含量的測定 采用苯酚—硫酸法[13]測定低聚糖含量.以葡萄糖含量(μg)為橫坐標(biāo)，D為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

y=0.007 5x+0.000 6(R2=0.999 5)

(4)

1.5.3 石莼功能性低聚糖純度的測定 由于通常提取得到的功能性低聚糖還存在部分葡萄糖和蔗糖等非功能性糖，而采用苯酚—硫酸法測定低聚糖含量時已將其計算在內(nèi)，但這些糖在發(fā)酵過程中能被酵母利用.因此，發(fā)酵前后功能性低聚糖質(zhì)量的比值可反映功能性低聚糖的純度(P).

P/%=M1/M2×100

(5)

(5)式中：M1—發(fā)酵后石莼功能性低聚糖的質(zhì)量(mg);M2—發(fā)酵前石莼功能性低聚糖的質(zhì)量(mg).

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003和DPS v7.05軟件進(jìn)行分析；以鄧肯新復(fù)極差法對單因素試驗的均值進(jìn)行顯著性檢驗，顯著性界值以P<0.01為極顯著，0.010.05為不顯著.

2 結(jié)果與分析

酵母發(fā)酵結(jié)合酶法純化石莼功能性低聚糖的均勻試驗方案及試驗結(jié)果見表2.

表2 石莼功能性低聚糖純化工藝擬水平均勻設(shè)計試驗結(jié)果1)Table 2 Results of (108) quasi-level uniform design on U.lactuca functional oligosaccharides purification

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3).

在優(yōu)化過程中，由于評價指標(biāo)石莼低聚糖含量(Y1)和蛋白脫除率(Y2)的取向是相反的，即在發(fā)酵過程中，石莼低聚糖含量要取低值，而在脫蛋白過程中，蛋白脫除率要取高值，因此，根據(jù)從優(yōu)隸屬度原則，將試驗指標(biāo)的實測數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)指標(biāo)的隸屬度，采用如下隸屬函數(shù)轉(zhuǎn)換公式[14]：

(6)

Y*=0.762+0.032X1+0.017X4+0.013X5

(7)

表3 實測數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化值Table 3 Actual measurement and converted value

表4 回歸系數(shù)t檢驗結(jié)果Table 4 t-value test of regression coefficient

(7)式中,自變量取各自代碼值，因變量取計算值.對回歸方程(7)進(jìn)行檢驗，得出相關(guān)系數(shù)R2=0.982 3，轉(zhuǎn)換后的相關(guān)系數(shù)Ra2=0.973 3，F(xiàn)=55.01，顯著水平P=0.000 1，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.008 6，說明該方程能很好地擬合去除游離糖和脫蛋白的過程.回歸系數(shù)t檢驗結(jié)果見表4.比較表4中各變量顯著性檢驗P的大小可以看出，各因素對去除游離糖和脫蛋白的強(qiáng)度大小為：酵母接種量>酶解液pH>酶解溫度.

根據(jù)回歸方程(7)并結(jié)合實際操作條件，酵母發(fā)酵結(jié)合酶法純化石莼功能性低聚糖的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為：酵母接種量7%、酶解液pH 4.0、酶解溫度45 ℃，結(jié)合零水平時的發(fā)酵時間4.0 h、酸性蛋白酶使用量250 U·g-1，此時目標(biāo)函數(shù)Y*的理論預(yù)測值為0.980(即樣品中石莼低聚糖含量的預(yù)測值為3.35%，蛋白脫除率的預(yù)測值為68.8%).按照上述優(yōu)化工藝參數(shù)組合，結(jié)合其他單因素的理想?yún)?shù)水平進(jìn)行3次擴(kuò)大性驗證試驗，得到低聚糖含量和蛋白脫除率的平均值分別為(3.37±0.02)%和(68.5±0.37)%，與理論預(yù)測值無統(tǒng)計學(xué)差異性(P>0.05)，進(jìn)一步驗證了數(shù)學(xué)回歸模型的合理性.

3 結(jié)論

Y*=0.762+0.032X1+0.017X4+0.013X5

(8)

綜合考慮實際生產(chǎn)的操作方便性，獲得經(jīng)校正的石莼功能性低聚糖粗品分離純化的關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化組合為：酵母接種量7%、發(fā)酵時間4.0 h、酸性蛋白酶使用量250 U·g-1、酶解液pH 4.0、酶解溫度45 ℃.以此為條件結(jié)合其他單因素試驗的理想?yún)?shù)水平進(jìn)行擴(kuò)大性驗證試驗，純化后樣品的低聚糖含量為(3.37±0.02)%，蛋白脫除率為(68.5±0.37)%，與理論預(yù)測值(3.35%和68.8%)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05).在此純化條件下，石莼功能性低聚糖的純度為81%.

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