c-di-GMP及其對(duì)細(xì)菌生物膜調(diào)控作用的研究進(jìn)展

全 旭 王鶴齡 張慧彥 許彤彤 王春陽(yáng) 崔云霞 孟維艷

作者單位：130021長(zhǎng)春，吉林大學(xué)口腔醫(yī)院（孟維艷為通訊作者）

環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是細(xì)菌內(nèi)廣泛存在的一類重要的第二信使分子，調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，生物膜形成，細(xì)胞毒性，細(xì)胞周期，細(xì)胞分裂等生理生化過(guò)程。生物膜是細(xì)菌的一種生存狀態(tài)，它的形成是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，由生物膜引起得感染普遍存在。本文主要概述了c-di-GMP的代謝和分子調(diào)控機(jī)制以及c-di-GMP在細(xì)菌生物膜形成過(guò)程中所起到的調(diào)控作用。

一、c-di-gmp的代謝及其分子調(diào)控機(jī)制

1.c-di-gmp的代謝

1987年，在葡糖醋酸桿菌中發(fā)現(xiàn)了環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP），并確認(rèn)其為纖維素合成酶異構(gòu)激活因子[1]。目前已知c-di-GMP是由2分子GTP在含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（DGCs）作用下形成，而在含有EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶（PDEs）的作用下被降解為pGpG 或 2 個(gè)分子的 GMP[2，3]。

（1）CCDEF結(jié)構(gòu)域與c-di-GMP的合成

1995年，在新月桿菌中PLeD的C端發(fā)現(xiàn)了GGEDF結(jié)構(gòu)域，報(bào)道了其高度保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe序列基序，但并未描述其生化特性。2001年，Pei等[4]對(duì)GGDEF的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，提出GGDEF結(jié)構(gòu)域是二鳥(niǎo)甘酸環(huán)化酶（DGCs）起催化作用的核心結(jié)構(gòu)域，并推測(cè)GGDEF是GTP的結(jié)合位點(diǎn)。PleD[5]是最早發(fā)現(xiàn)的DGC，Paul等證實(shí)了含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的PleD可將 GTP合成為 c-di-GMP。GG（D/E）EF基序是GGDEF 結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)[2，6，7]，又稱為 A 位點(diǎn)，它與底物GTP結(jié)合，催化c-di-GMP的合成。在該活性中心上游的5個(gè)氨基酸殘基處有一個(gè)RXXD基序，稱為抑制位點(diǎn)（I位點(diǎn)）。當(dāng)合成的c-di-GMP與I位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑反饋抑制DGCs的催化反應(yīng)。這種反饋調(diào)節(jié)可以使細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP濃度處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡[8，9]。大多數(shù)GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)都具有I位點(diǎn)，如PleD及WspR。但也有的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)沒(méi)有I位點(diǎn)[9，10]，例如野油菜黃單胞菌中的XCC4471蛋白，其包含的GGDEF結(jié)構(gòu)域并沒(méi)有I位點(diǎn)，而是通過(guò)c-di-GMP二聚體與A位點(diǎn)結(jié)合形成XCC4471GGDEF-（c-di-GMP）2復(fù)合體競(jìng)爭(zhēng)性抑制DGCs的活性[11]。

（2）EAL及HD-GYP結(jié)構(gòu)域與c-di-GMP的分解

1986年，Benziman等人在從葡糖醋酸桿菌中提取出PDEs，并證實(shí)其可將c-di-GMP水解為線性di-GMP，如 5‘-pGpG，最終水解為單體 pG。EAL[12]通過(guò)與金屬離子Mg2+或者M(jìn)n2=結(jié)合激活PDEs的活性，而與Ca2+及Zn2+結(jié)合則會(huì)抑制PDEs的活性。EAL活性的激活依賴于水合金屬簇，它可以水解c-di-GMP的磷酸酯鍵。HD-GYP[13]結(jié)構(gòu)域?qū)儆贖D家族，這個(gè)家族的成員可水解各種底物。Ryan等證實(shí)野油菜黃單胞菌中的HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白R(shí)pfG參與c-di-GMP的降解。在異源宿主中表達(dá)時(shí)，HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白R(shí)pfG可功能性的取代EAL結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶（PDE），將HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白R(shí)pfG提純，可發(fā)現(xiàn)其具有磷酸二酯酶（PDE）的活性[14]目前對(duì)有酶活性的HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)特征所知甚少。食菌蛭弧菌中的Bd1817是第一個(gè)被確定結(jié)構(gòu)的HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白，由于Bd1817其GYP基序缺乏一個(gè)保守的酪氨酸，故并不具有磷酸二酯酶（PDE）活性，在體外也不能和c-di-GMP 結(jié)合[15，16]。

2.c-di-GMP的分子調(diào)控機(jī)制

c-di-GMP的調(diào)控是分子水平的，包括：①變構(gòu)調(diào)節(jié)酶活性或蛋白質(zhì)功能；②通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子近一步調(diào)控基因的表達(dá)；③通過(guò)直接作用于核糖開(kāi)關(guān)調(diào)控基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)菌感受到周圍環(huán)境變化帶來(lái)的刺激時(shí)，可通過(guò)調(diào)控c-di-GMP的合成酶和水解酶來(lái)控制細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的水平，不同濃度的胞內(nèi)c-di-GMP可被c-di-GMP的受體蛋白感知而引起下游分子活動(dòng)的變化，從而實(shí)現(xiàn)c-di-GMP的信號(hào)傳導(dǎo)。例如c-di-GMP可調(diào)控細(xì)菌從浮游狀態(tài)到靜止?fàn)顟B(tài)的可逆性轉(zhuǎn)變，已證實(shí)在大腸桿菌、銅綠假單胞菌及沙門氏菌中，高濃度的c-di-GMP可促使細(xì)菌聚集從而形成生物膜，而低濃度的c-di-GMP可促使生物膜分解[17]；遺傳篩選也發(fā)現(xiàn)c-di-GMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑可調(diào)控多種動(dòng)植物病原菌的毒力[18～20]；最近發(fā)現(xiàn)c-di-GM與其他核苷酸信號(hào)（p）ppGpp可協(xié)同調(diào)控分枝桿菌的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞分裂以及全基因組的表達(dá)[21]。

與其他核苷酸信號(hào)通路一樣，c-di-GMP的調(diào)控需要其受體蛋白的參與。目前已知的受體主要有兩類：效應(yīng)蛋白和核糖體開(kāi)關(guān)，效應(yīng)蛋白是c-di-GMP在細(xì)菌體內(nèi)的下游作用靶點(diǎn)如PilZ、FleQ[22，23]。PilZ具有兩個(gè)保守的氨基酸殘基基序RXXXR和D/NXSXXG，當(dāng)c-di-GMP與含有PilZ結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白結(jié)合時(shí)，這兩個(gè)基序發(fā)揮重要作用。如含有PilZ結(jié)構(gòu)域的FlgZ受體蛋白和c-di-GMP結(jié)合時(shí)，通過(guò)與MotCD（促進(jìn)銅綠假單胞菌群集運(yùn)動(dòng)的鞭毛定子）相互作用進(jìn)而抑制銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)[24，25]。FleQ作為一種新型的c-di-GMP受體，可直接與細(xì)菌胞外多糖及鞭毛基因的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，參與細(xì)菌胞外多糖及鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而差異性調(diào)節(jié)生物膜基質(zhì)成分的表達(dá)[26]。核糖開(kāi)關(guān)是一種RNA順式作用元件，通常由適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺(tái)域兩部分組成[27]，適體結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合后通過(guò)構(gòu)象的改變調(diào)控下游基因的表達(dá)[28]。根據(jù)作用機(jī)制可將c-di-GMP的核糖開(kāi)關(guān)分為c-di-GMPⅠ型和c-di-GMPⅡ型[29，30]。c-di-GMP Ⅰ型核糖開(kāi)關(guān)與c-di-GMP結(jié)合后，可改變表達(dá)平臺(tái)域的構(gòu)象，抑制mRNA，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)[29]。c-di-GMPⅡ型核糖開(kāi)關(guān)基于其表達(dá)平臺(tái)域具有核酶活性，與c-di-GMP結(jié)合后能催化自我剪切mRNA，形成外顯子，暴露核糖結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[30]。如在艱難梭菌中，c-di-GMP與被稱為 Cdi2_4的c-di-GMPⅡ型核糖開(kāi)關(guān)特異性結(jié)合可調(diào)控Ⅳ型鞭毛（T4P）基因表達(dá)，從而促進(jìn)艱難梭菌的聚集[31]。

二、c-di-gmp在細(xì)菌生物膜形成中的調(diào)控作用

1.生物膜的形成

生物膜是指細(xì)菌黏附于生物或非生物接觸表面，分泌胞外基質(zhì)并將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌膜狀聚集物[32]。胞外基質(zhì)是生物膜的主要支架，占到生物膜總體積的85%，可促進(jìn)生物膜內(nèi)細(xì)胞之間的交流。胞外基質(zhì)主要包括胞外多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂類及細(xì)胞殘骸等，其中，胞外多糖又是胞外基質(zhì)的主要成分[33]。生物膜的形成依賴于一系列的細(xì)胞因子及信號(hào)通路的調(diào)控，其形成過(guò)程可為三個(gè)階段：第一個(gè)階段是細(xì)菌的可逆性、不可逆性黏附；第二個(gè)階段是生物膜的形成；第三個(gè)階段是生物膜的成熟及分散。

2.c-di-GMP對(duì)細(xì)菌黏附的影響

細(xì)菌最初和表面接觸時(shí)，為克服表面的張力通過(guò)鞭毛介導(dǎo)的泳動(dòng)（swimming motility）使細(xì)菌到達(dá)物體的表面。FleQ是鞭毛合成的主導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，它與flhA結(jié)合可啟動(dòng)鞭毛基因的級(jí)聯(lián)表達(dá)[34]。FleQ的活性不但與 FLeN有關(guān)[34，35]，也受 c-di-GMP的調(diào)控[26]。目前已證實(shí)，F(xiàn)LeN與c-di-GMP均可通過(guò)抑制ATP酶的活性調(diào)整FleQ的功能，使FleQ不能調(diào)控下游鞭毛基因，進(jìn)而抑制鞭毛的合成[36]。YcgR作為c-di-GMP的受體，其包含PliZ結(jié)構(gòu)域，當(dāng)c-di-GMP與YcgR結(jié)合時(shí)也可抑制鞭毛的合成[37]。c-di-GMP對(duì)細(xì)菌鞭毛的抑制發(fā)生在細(xì)菌的可逆性黏附之前可阻止生物膜的早期形成，發(fā)生在可逆性黏附之后可消除表面動(dòng)力使細(xì)菌穩(wěn)定的黏附于接觸表面促使可逆性黏膜向不可逆性黏附轉(zhuǎn)變。

細(xì)菌的不可逆性黏附與細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)（swarming motility）、顫動(dòng)（twitching motility）及胞外多糖密切相關(guān)。目前已證實(shí)DGCs及PDEs影響細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)，研究發(fā)現(xiàn)SadC是一種DGC，BifA是一種PDE，它們可通過(guò)調(diào)節(jié)c-di-GMP的水平進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的表面運(yùn)動(dòng)及不可逆性黏附。如在銅綠假單胞菌中sadC突變型菌株可促進(jìn)細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)，抑制細(xì)菌的不可逆性黏附；bifA突變型菌株則與此相反，即其可促進(jìn)細(xì)菌的不可逆性黏附，抑制細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)；而只有bifA型突變菌株對(duì)細(xì)菌的顫動(dòng)起抑制作用[38，39]。Pel與Psl為銅綠假單胞菌的兩種胞外多糖，Colvin等人發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌pel型突變菌株和psl型突變菌株其生物膜發(fā)育的單細(xì)胞階段是受抑制的，并且與非突變型菌株相比突變型菌株形成的生物膜量也有所減少[40]。

3.c-di-GMP與生物膜的成熟

細(xì)菌的黏附于表面后增殖形成微菌落，然后聚集成大菌落，最后形成成熟的生物膜。

而胞外多糖在細(xì)菌的黏附及生物膜的成熟階段都發(fā)揮的重要的作用。胞外多糖具有多樣性，比如銅綠假單胞菌能產(chǎn)生三種不同的胞外多糖即alginate，Pela和Psl。alginate由銅綠假單胞菌的黏液性菌株產(chǎn)生，c-di-GMP可調(diào)控alginate的合成。含PilZ結(jié)構(gòu)域的Alg44是c-di-GMP的受體蛋白，其在體外與c-di-GMP結(jié)合可以調(diào)節(jié)alginate的合成及聚合，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP呈高濃度表達(dá)時(shí)，alginate的合成也相應(yīng)有所增加[41，42]。Psl與Pel不僅參與細(xì)菌的黏附，也與生物膜的成熟有關(guān)[40]。在生物膜的成熟過(guò)程的早期，Pel作為微生物群落形成生物膜的結(jié)構(gòu)支架，并且與生物膜的致密性有關(guān)[43]。FleQ作為c-di-GMP的受體也參與調(diào)節(jié)胞外多糖Pel的基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，與其他的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子所不同的是FleQ即可抑制pel的轉(zhuǎn)錄又可激活pel的轉(zhuǎn)錄。比如當(dāng)FleN及c-di-GMP不存在時(shí)，F(xiàn)leQ可與pel的啟動(dòng)子結(jié)合從而抑制pel的轉(zhuǎn)錄。但當(dāng)FleQ與c-di-GMP或者FleN結(jié)合后，F(xiàn)leQ對(duì)pel的抑制作用也被解除，同時(shí)激活pel的轉(zhuǎn)錄[44，45]c-di-GMP與Pls之間是一種正反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系，即當(dāng)具有DGCs活性的蛋白刺激c-di-GMP的合成時(shí)，c-di-GMP又可促進(jìn)Pls的合成，而合成的Pls反過(guò)來(lái)又作用于c-di-GMP。Irie等人發(fā)現(xiàn)，Pls可以通過(guò)調(diào)節(jié)兩種DGCs（SiaD和SadC）促使胞內(nèi)c-di-GMP呈高濃度表達(dá)，高濃度的c-di-GMP又可促進(jìn)Pls及其他生物膜成分的產(chǎn)生[46]。

目前對(duì)微菌落演變?yōu)榇缶涞臋C(jī)制知之甚少，可能是隨著時(shí)間的推移，微菌落繼續(xù)發(fā)展成為大菌落。另外生物膜的成熟或許也與基因組的調(diào)控有關(guān)，但不可否認(rèn)的是胞外多糖在生物膜的成熟階段發(fā)揮著重要作用。Luyan M等人研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌的黏附階段，Pls分布在細(xì)菌的表面以促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用及胞外基質(zhì)的形成，利于細(xì)菌在表面形成生物膜；在生物膜的成熟階段，Pls的分布具有差異性，即Pls主要積聚在生物膜的周圍，而中心區(qū)的Pls較少甚至沒(méi)有。但當(dāng)生物膜分解時(shí)，浮游的細(xì)菌則會(huì)分布在Pls較少的中心區(qū)，這也表明Pls為細(xì)菌的再黏附提供了一定的條件[47]。

由生物膜引起的感染普遍存在，如：肺囊性纖維化、隱形眼鏡相關(guān)角膜炎、齲病、種植體周圍炎等。常規(guī)的抗生素藥物治療很難徹底清除生物膜，并且容易誘發(fā)細(xì)菌的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)生物膜中細(xì)菌的細(xì)胞耐藥性是浮游細(xì)菌細(xì)胞耐藥性的1000倍，這也與生物膜的胞外基質(zhì)或者eDNA有關(guān)[48]。在生物膜中大量的胞外基質(zhì)將細(xì)菌包繞，形成的狹窄空間使藥物難以穿透生物膜；并且生物膜中的細(xì)菌可通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)感知環(huán)境變化，產(chǎn)生自體誘導(dǎo)因子傳遞信號(hào)，分泌毒力因子和細(xì)胞外基質(zhì)等對(duì)抗環(huán)境作用，實(shí)現(xiàn)菌種內(nèi)及菌種間的相互作用和協(xié)調(diào)，這些機(jī)制增加了生物膜對(duì)環(huán)境機(jī)制的抵抗性。c-di-GMP是細(xì)菌內(nèi)廣泛存在的第二信使，目前我們已經(jīng)知道在一些細(xì)菌體內(nèi)c-di-GMP對(duì)生物膜的調(diào)控與其濃度有關(guān)，也已經(jīng)證實(shí)許多調(diào)節(jié)c-di-GMP代謝的酶參與細(xì)菌黏附作用及生物膜的成熟。那么是否能通過(guò)調(diào)控細(xì)菌體內(nèi)c-di-GMP的水平或者相關(guān)的代謝酶來(lái)破壞細(xì)菌生物膜，從根本上治療由細(xì)菌生物所引起的疾病還有待于進(jìn)一步研究。