腺苷預處理對氧糖剝奪復氧糖后星形膠質(zhì)細胞中血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素-1水平的影響

馬世江，尉 娜，韓艷艷，譚 軍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003）

腦卒中是臨床上常見的腦血管疾病，致殘率極高，居人類病死原因的第2位［1］，其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的80%。缺血性腦卒中的治療目的主要是改善腦血流，減輕腦缺血后的神經(jīng)損害，提高腦細胞對缺血的耐受。腦血流的恢復不可避免地導致缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）［2］，缺血耐受是機體抵抗 IRI的一種生物現(xiàn)象。目前，通過藥物啟動和促進內(nèi)源性保護機制而抑制IRI已成為國內(nèi)外研究的熱點。本研究選擇腺苷作為缺血預處理藥物，探討腺苷預處理對腦IRI大鼠星形膠質(zhì)細胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）水平的影響，為臨床應(yīng)用腺苷預防和治療缺血性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Sprague Dawley大鼠60只，雌雄不限，出生24 h內(nèi)，體質(zhì)量10～12 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器高糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；腺苷注射液（沈陽光大制藥有限公司，國藥準字H20030320）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）。CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（德國Heraeu公司）；TD2-60B型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 實驗方法參照文獻［3-4］進行星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)。體積分數(shù)75%乙醇消毒大鼠，放入超凈工作臺內(nèi)，用眼科剪在乳鼠后頸部做倒“T”型切口，挑起顱骨剪開，暴露雙側(cè)大腦半球，依據(jù)星形膠質(zhì)細胞在大腦皮層分布特點選取大鼠大腦皮質(zhì)，準確剝離腦膜、血管膜，通過機械吹打法和差速貼壁法進行處理，然后進行細胞傳代培養(yǎng)。對培養(yǎng)至第3代的星形膠質(zhì)細胞應(yīng)用免疫熒光法進行膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鑒定。然后將第3代星形膠質(zhì)細胞傳代至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)至細胞貼壁并伸出突觸后，隨機分為正常對照組、氧糖剝奪組和腺苷預處理組。正常對照組細胞不進行氧糖剝奪，在氧糖剝奪期及復氧糖期均更換高糖DMEM。氧糖剝奪組細胞在氧糖剝奪期更換為無糖、無血清的DMEM；腺苷預處理組細胞在氧糖剝奪前24 h給予含100μmol·L-1腺苷的高糖DMEM培養(yǎng)，氧糖剝奪期將培養(yǎng)基更換為無糖、無血清DMEM。氧糖剝奪期，將氧糖剝奪組和腺苷預處理組細胞放入含體積分數(shù)95%氮氣、體積分數(shù)5%CO2的自制缺氧倉內(nèi)缺氧8 h；在復氧糖期，氧糖剝奪組及腺苷預處理組細胞培養(yǎng)基更換為預熱的含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM，隨即轉(zhuǎn)移至37℃、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。正常對照組在37℃、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.4 星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察用德國Leica光學顯微鏡觀察3組星形膠質(zhì)細胞在復氧糖24 h后的形態(tài)變化。

1.5 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，M TT）法檢測各組星形膠質(zhì)細胞的活力取各組大鼠星形膠質(zhì)細胞以1×108L-1密度接種于96孔板，每孔加入MTT 50μL，混合均勻，放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，然后1 000 r·min-1離心5min，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），搖晃 10 min，在 37℃條件下，450 nm波長處測細胞吸光度值，每組設(shè)5個復孔，重復測定3次，吸光度值越高代表細胞活力越高。

1.6 ELISA法測各組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中VEGF和Ang-1水平取各組大鼠星形膠質(zhì)細胞以密度為5×107L-1接種于24孔板，每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)基上清液中VEGF和Ang-1水平。

1.7 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較均采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠星形膠質(zhì)細胞形態(tài)變化復氧糖24 h后，正常對照組星形膠質(zhì)細胞生長狀態(tài)良好，大量的突觸在相連的細胞之間形成（圖1A）；氧糖剝奪組星形膠質(zhì)細胞胞體變圓，水腫明顯，細胞形態(tài)由不規(guī)則形變成梭形，突起明顯變短甚至消失（圖1B）；腺苷預處理組星形膠質(zhì)細胞水腫較氧糖剝奪組輕，細胞排列相對整齊（圖1C）。

圖1 各組大鼠星形膠質(zhì)細胞形態(tài)（×400）Fig.1 M orphology of astrocyte in each group（×400）

2.2 各組大鼠星形膠質(zhì)細胞活力比較正常對照組、氧糖剝奪組和腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞活力分別為 0.698±0.059、0.196±0.062、0.412±0.009。氧糖剝奪組大鼠星形膠質(zhì)細胞活力低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（q＝3.561，P＜0.05）；腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞活力高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計學意義（q＝2.102，P＜0.05）。

2.3 各組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平比較正常對照組、氧糖剝奪組、腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平分別為（0.038±0.005）、（0.053±0.007）、（0.084±0.006）μg·L-1；氧糖剝奪組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（q＝1.394，P＜0.05）；腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平顯著高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計學意義（q＝1.584，P＜0.05）。

2.4 各組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平比較正常對照組、氧糖剝奪組、腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平分別為（0.030±0.007）、（0.049±0.008）、（0.080±0.004）μg·L-1。氧糖剝奪組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（q＝1.633，P＜0.05）；腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平顯著高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計學意義（q＝1.632，P＜0.05）。

3 討論

機體的自我保護作用在腦缺血發(fā)生后會產(chǎn)生代償，缺血區(qū)血流改善有利于減輕缺血性腦梗死的損害［5］。在缺血性腦卒中的病理生理過程中，缺血區(qū)中心部位的腦細胞在一定時間內(nèi)會發(fā)生不可逆損傷，血流恢復是改善缺血損傷的關(guān)鍵。IRI的提出受到醫(yī)學界廣泛關(guān)注，腦缺血后會出現(xiàn)缺氧、自由基和興奮性氨基酸增多、細胞內(nèi)鈣超載等病理生理變化。研究顯示，谷氨酸的興奮性毒性是腦IRI的重要機制之一［6］。因此，降低谷氨酸水平，也是減輕腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的重要策略。

腺苷作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，可與G蛋白耦聯(lián)受體相結(jié)合，激活三磷腺苷依賴的鉀離子通道，阻止興奮性氨基酸誘導的神經(jīng)元除極效應(yīng)，抑制興奮性氨基酸釋放，降低細胞膜對Ca2+的通透性，擴張血管，抑制炎性細胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集，減輕炎性細胞、自由基導致的血管內(nèi)皮損傷［7-8］。腺苷在臨床中較常用，也是腦缺血疾病相關(guān)基礎(chǔ)研究的熱點，具有效果好、價格便宜等優(yōu)點［9］。本實驗選擇腺苷進行缺血預處理，通過對大鼠星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察及細胞活力檢測發(fā)現(xiàn)，腺苷預處理組大鼠星形膠質(zhì)細胞活力顯著高于氧糖剝奪組，表明腺苷預處理可以對細胞發(fā)揮保護作用，改善IRI。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要支持成分，具有聯(lián)系神經(jīng)元、調(diào)節(jié)神經(jīng)元代謝、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、組成血-腦屏障及促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復的作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)，在腦梗死大鼠模型中，梗死灶周圍的星形膠質(zhì)細胞被激活［11］，說明激活的星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元損傷修復過程中起到了關(guān)鍵作用。研究表明，血管再通與神經(jīng)元的增殖密切相關(guān)［12］。腦IRI后，血管再生可以提高損傷神經(jīng)元的恢復，促進神經(jīng)修復，改善后遺癥。生長因子、神經(jīng)干細胞、黏附因子等可以促進血管生成，VEGF和Ang-1最具代表性。VEGF和Ang-1是一類促進血管形成和分化的重要調(diào)節(jié)因子，與血管的生成關(guān)系密切［13-15］。研究表明，腦缺血會誘導VEGF和Ang-1的生成，從而改善缺血邊緣區(qū)域的血供和恢復缺血腦組織的功能［16］。唐清等［17］研究顯示，VEGF具有神經(jīng)保護作用。SUN等［18］對大腦中動脈阻塞模型大鼠腦內(nèi)注射外源性VEGF，結(jié)果顯示，VEGF組新生血管密度較正常組高2倍，較缺血對照組高4倍。而且血清中VEGF水平的升高還可以改善缺血性腦血管病患者的認知功能［19］。Ang-1是血管內(nèi)皮細胞特異性受體酪氨酸激酶Tie-2的配體，通過Tie-2的磷酸化，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，促進血管內(nèi)皮細胞出芽、遷移，穩(wěn)定血管，促進血管生長。VEGF與Ang-1關(guān)系密切，VEGF促進早期血管形成，形成原始血管網(wǎng)，Ang-1則在隨后的血管重建中發(fā)揮作用，促進成熟的血管網(wǎng)形成。Ang-1還能夠抵抗VEGF以及炎癥引起的血管滲漏，是一種能夠抵抗血管滲漏的內(nèi)源性蛋白質(zhì)因子，它能促進和互補VEGF促血管新生的功能［20］。莊越等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1可能通過減輕腦血管炎性反應(yīng)和維持血管內(nèi)皮細胞完整性來減輕腦血管內(nèi)皮細胞IRI，從而起到保護作用。本研究結(jié)果顯示，大鼠星形膠質(zhì)細胞通過氧糖剝奪，可以刺激Ang-1表達增加；通過腺苷預處理可以進一步增加Ang-1表達，抑制IRI。

綜上所述，腺苷預處理可以使氧糖剝奪后的星形膠質(zhì)細胞損傷減輕，細胞活力增加；表明腺苷預處理可能是通過上調(diào)VEGF和Ang-1的表達來減輕大腦損傷，從而產(chǎn)生腦保護作用。本研究為缺血性腦卒中的臨床治療提供了新的思路。

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