血管生成素樣蛋白家族在脂代謝中的作用研究進(jìn)展

朱苗苗 周 潔 秦彥文

血管生成素樣蛋白家族(angiopoietin-like proteins, ANGPTLs)是一類分泌蛋白，其結(jié)構(gòu)與血管生成素蛋白家族的成員具有很大相似性，并對脂代謝、血管生成和干細(xì)胞生物學(xué)等具有多種效應(yīng)[1-2]。然而，ANGPTLs不結(jié)合血管生成素受體，提示ANGPTLs的功能可能與血管生成素不同。ANGPTL家族包含八個成員，除ANGPTL5只在人類表達(dá)，其他ANGPTLs成員在人類和小鼠中均有表達(dá)[1]。ANGPTL1-7都由N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域組成，ANGPTL8是ANGPTL家族的非典型成員，缺乏N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域[3]。另外，ANGPTL在N端含有高度疏水性的區(qū)域，這是蛋白質(zhì)分泌信號序列的典型特征，ANGPTL8的N端結(jié)構(gòu)域與ANGPTL3和ANGPTL4有20%的同一性，表明它們可能具有相似的功能[1]。研究報道，ANGPTLs中ANGPTL3、ANGPTL4和ANGPTL8均可影響脂質(zhì)代謝[1]。故本文主要綜述ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8在脂代謝中的作用及其機(jī)制。

1.血管生成素樣蛋白3

血管生成素樣蛋白3是由460個氨基酸構(gòu)成的糖蛋白，分子量為70kDa，該基因位于染色體1p31.1-p22.3，有7個外顯子，在人和小鼠體內(nèi)，ANGPTL3是肝臟特異性表達(dá)分泌的因子，具有兩個功能結(jié)構(gòu)域，即N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域，ANGPTL3經(jīng)前體蛋白轉(zhuǎn)換酶識別 ANGPTL3蛋白的221-224位，切割去掉C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域后，釋放其N端結(jié)構(gòu)域，才會變得有活性[2]。

(1)血管生成素樣蛋白3與脂代謝的關(guān)系 臨床研究表明，ANGPTL3在脂代謝中發(fā)揮重要作用。通過對家族性混合低脂血癥家系進(jìn)行全外顯子測序，ANGPTL3功能缺失突變的純合子或復(fù)合雜合子患者血清中TG、VLDL-C、LDL-C和HDL-C的水平都顯著降低[2]。在一個混合性低脂血癥家系中，ANGPTL3功能缺失變異攜帶者與非攜帶者相比，血清TG減少17%、LDL-C減少12%，冠心病發(fā)病率下降34%，循環(huán)中ANGPTL3濃度最低的個體與最高濃度者相比，心肌梗死發(fā)生率降低35%[4]。一項多中心研究對58 335例參與者進(jìn)行全外顯子測序，ANGPTL3功能缺失型變異攜帶者的TG、HDL-C和LDL-C水平顯著低于非攜帶者，ANGPTL3抗體能使血脂異?；颊呖崭筎G水平降低76%、LDL-C水平降低23%；在血脂異常小鼠中，與對照組相比，ANGPTL3單克隆抗體能顯著減少動脈粥樣硬化病變面積和壞死脂質(zhì)核心[5]。人體給予ANGPTL3反義寡核苷酸6周后，ANGPTL3水平降低，同時也降低了致動脈粥樣化的脂蛋白(包括TG、非HDL-C、載脂蛋白B和載脂蛋白C-III)的水平[6]。小鼠靶向給予ANGPTL3的反義寡核苷酸，ANGPTL3水平降低，血清TG和LDL-C水平均降低，肝TG含量降低，同時減緩了動脈粥樣硬化的發(fā)展[6]。對3例純合子家族性高膽固醇血癥患者給予ANGPTL3抗體(REGN1500)后，血清LDL-C水平降低了46%[7]。目前，血清ANGPTL3與血脂水平的關(guān)系是不一致的。有研究表明，循環(huán)ANGPTL3與血清LDL-C和HDL-C的水平呈顯著正相關(guān)，但是與血清TG沒有相關(guān)性；但是，另一項研究表明，循環(huán)ANGPTL3和HDL-C水平呈正相關(guān)，但與血清TG水平呈負(fù)相關(guān)[2]。有待于進(jìn)一步研究。

(2)血管生成素樣蛋白3ANGPTL3調(diào)節(jié)脂代謝的機(jī)制 ANGPTL3參與脂質(zhì)代謝的第一個證據(jù)來自KK / San小鼠的研究，ANGPTL3功能缺失后，小鼠表現(xiàn)為極低的血清TG水平，此外，ANGPTL3過表達(dá)后成功的逆轉(zhuǎn)了這種表型，并導(dǎo)致了野生型小鼠的高TG血癥[2]。后續(xù)的其他研究，也驗證了這一表型，在小鼠中敲除ANGPTL3能降低血清TG和膽固醇水平，VLDL-TG的清除率增加[2]。

體內(nèi)水解TG的酶主要是脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)，LPL主要表達(dá)于氧化或儲存游離脂肪酸的組織中，如心臟、骨骼肌、棕色脂肪組織和白色脂肪組織，在這些實質(zhì)細(xì)胞中，LPL被糖基磷脂酰肌醇錨定的高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1(GPIHBP1)轉(zhuǎn)運(yùn)并附著到毛細(xì)血管內(nèi)皮發(fā)揮水解TG的作用，以二聚體為活性狀態(tài)[8]。ANGPTL3敲除小鼠表現(xiàn)出心臟和骨骼肌中表現(xiàn)出較高的LPL活性，表明ANGPTL3抑制心臟和骨骼肌組織中的LPL活性[9]。ANGPTL3主要是通過抑制LPL的活性而使TG水平升高[2]。在體外細(xì)胞水平研究表明ANGPTL3可與ANGPTL8結(jié)合，并且該復(fù)合物是ANGPTL3有效的結(jié)合和抑制LPL的必須物[10]。與N-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的ANGPTL3單克隆抗體，能增加小鼠和猴子血清LPL酶活性，降低血清TG水平[11]。除了影響LPL活性，ANGPTL3還能抑制內(nèi)皮酯酶的活性，在ANGPTL3敲除鼠中表現(xiàn)出低HDL-C水平，在體外HEK293細(xì)胞水平進(jìn)一步研究，ANGPTL3是通過抑制內(nèi)皮酯酶的活性，從而降低血漿HDL-C水平[2]。

由上可知，ANGPTL3主要抑制LPL和內(nèi)皮酯酶兩種酶的活性，來發(fā)揮調(diào)節(jié)TG和HDL-C的作用。但是，由于LPL或內(nèi)皮酯酶不能水解膽固醇，所以ANGPTL3缺乏導(dǎo)致低LDL-C水平的機(jī)制仍然難以捉摸。新近一項研究，分別向野生型小鼠、LDLR-/-、LRP1-/-、APOE-/-小鼠體內(nèi)注射ANGPTL3中和抗體(REGN1500)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照抗體組相比，中和抗體組血清LDL-C水平均降低，ANGPTL3的失活不影響肝臟對含ApoB的脂蛋白的分泌[12]。但是，在LDLR-/-小鼠中給予ANGPTL3抗體，與對照空抗體組相比LDL-C水平降低、ApoB100的分泌減少和LDL / VLDL攝取增加；ApoB100轉(zhuǎn)基因的LDLR-/-小鼠與非ApoB100轉(zhuǎn)基因組相比，給予ANGPTL3抗體后LDL-C水平降低減少，說明小鼠拮抗ANGPTL3是通過減少ApoB100的分泌和增加LDL / VLDL攝取，從而導(dǎo)致低LDL-C水平[13]。但是其具體機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

2.血管生成素樣蛋白4

ANGPTL4是由406個氨基酸組成的糖蛋白，分子量為45-65kDa，其基因位于染色體19p13.3，有7個外顯子。在人體和小鼠中，ANGPTL4分布較廣泛，主要在白色脂肪組織和肝臟中表達(dá)，在小腸和心臟組織也均有表達(dá)[3]。研究表明，ANGPTL4也需要切割去掉C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域后，才會變得有活性，運(yùn)動和禁食可誘導(dǎo)ANGPTL4的表達(dá)，主要通過脂肪細(xì)胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)而實現(xiàn)，與ANGPTL3類似，前體蛋白酶可識別ANGPTL4蛋白161-164位的前蛋白轉(zhuǎn)化酶識別序列(RRKP)，從而切割釋放其N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，來發(fā)揮抑制LPL的作用[1]。

(1) ANGPTL4與脂代謝的關(guān)系 多項全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)結(jié)果表明，ANGPTL4基因變異與血脂水平有關(guān)。丹麥哥本哈根心臟研究中心多人種研究表明ANGPTL4的E40K變異與血清TG和HDL-C濃度降低有關(guān)，在南亞和歐洲人群中，ANGPTL4功能缺失型變異可使血清TG降低35%[14]，同時，可使冠心病的發(fā)病風(fēng)險降低53%[14]。研究表明，冠心病患者血清ANGPTL4水平明顯高于正常對照組，但是，多因素回歸分析結(jié)果顯示ANGPTL4與冠心病的嚴(yán)重程度之間并沒有持續(xù)的正相關(guān)關(guān)系[15]。

(2) ANGPTL4調(diào)節(jié)脂代謝的機(jī)制 ANGPTL4 敲除小鼠禁食狀態(tài)下白色脂肪和肌肉中的LPL活性均較高，導(dǎo)致了嚴(yán)重的低甘油三酯血癥，而在進(jìn)食狀態(tài)下，肌肉中LPL活性被抑制，因此與空腹?fàn)顟B(tài)相比，TG稍有增高。ANGPTL4蛋白可抑制LPL二聚體的形成，將LPL轉(zhuǎn)化為無活性的單體，從而不可逆地抑制LPL活性[1]。生理狀態(tài)下， ANGPTL4可以結(jié)合并抑制與GPIHBP1結(jié)合的LPL的活性，并可極大降低LPL對GPIHBP1的親和力[16]。

缺乏ANGPTL4的小鼠血清TG水平降低，反之，ANGPTL4過表達(dá)會使血清TG增加[17]。小鼠體內(nèi)注射抗ANGPTL4 N端結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，同樣會使血清TG水平降低，ANGPTL4的單克隆抗體在小鼠和猴子中能降低TG水平[18]。與野生型小鼠相比ANGPTL4-/-小鼠TG、LDL-C、HDL-C和TC均降低，ApoE-/-小鼠中ANGPTL4的缺乏可顯著抑制巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，從而抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；但是，小鼠造血細(xì)胞中ANGPTL4的缺失，可通過調(diào)節(jié)骨髓祖細(xì)胞擴(kuò)增和分化，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成和血管炎癥來增加動脈粥樣硬化形成[19]。

3.血管生成素樣蛋白8

ANGPTL8是ANGPTL家族的非典型成員，又名GM6484、RIFL、lipasin和betatrophin，是由198個氨基酸構(gòu)成的分泌蛋白，分子量為22kDa，其基因位于染色體19p13.2 a，其結(jié)構(gòu)缺少C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域、糖基化位點(diǎn)和形成二硫鍵的氨基酸[3]。在人體，ANGPTL8由肝臟特異性表達(dá)分泌，而在小鼠，ANGPTL8主要由肝臟和脂肪組織分泌[20]。與ANGPTL3、ANGPTL4不同，ANGPTL8不需要經(jīng)過切割就可保持有活性的狀態(tài)[3]。禁食抑制ANGPTL8的表達(dá)，但是再喂養(yǎng)可高度誘導(dǎo)其表達(dá)，缺乏不同類型固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Srebp)的同種小鼠，進(jìn)食后ANGPTL8表達(dá)均增加[20]，這表明，除進(jìn)食外，ANGPTL8的表達(dá)還受多種因素的調(diào)節(jié)，且這種調(diào)節(jié)獨(dú)立于Srebp。在HepG2細(xì)胞中，AMPK可以抑制LXR / SREBP-1信號通路，誘導(dǎo)ANGPTL8的表達(dá)[21]，并且在葡萄糖存在的情況下，胰島素能促進(jìn)ANGPTL8的表達(dá)[22]。 此外，甲狀腺激素也可上調(diào)ANGPTL8的表達(dá)[23]。

(1)血管生成素樣蛋白8與脂代謝的關(guān)系 多個GWAS研究結(jié)果均顯示ANGPTL8基因變異與脂質(zhì)譜有關(guān)。在歐裔美洲人、非裔美洲人和西班牙人群中，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)rs2278426(R59W)變異均與LDL-C和HDL-C水平相關(guān)[20]。同樣，包含4 361例墨西哥人群的GWAS研究結(jié)果顯示，WW純合子的HDL-C比RR純合子低14%[24]；DHS隊列中的非裔美國人的WW純合子的LDL-C水平比在RR純合子低15%[24]。在中國漢族人群中，攜帶ANGPTL8 rs2278426(GA / AA)型的人群的TC和LDL-C水平均低于GG型。但是，在中國仫佬族人群中，這些基因型之間的血脂水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)差異[25]。在歐洲人群中，ANGPTL8 rs145464906(從CAG到TAG)變異，導(dǎo)致了ANGPTL8蛋白的截短，使得 HDL-C水平增加10mg / dL，TG水平降低15%[26]，SNP rs737337也被發(fā)現(xiàn)與HDL-C水平相關(guān)[3]。 人體中，循環(huán)ANGPTL8濃度與血清TG、LDL-C水平顯著正相關(guān)，與糖尿病患者的HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)[27]。 然而，另一項研究顯示ANGPTL8濃度與血脂水平無關(guān)[28]，而HDL-C低或TG水平高的血脂異?；颊?，血清ANGPTL8濃度顯著降低[29]。我們猜測，這些差異可能是由于高血糖的影響，因為血糖水平與循環(huán)ANGPTL8濃度有關(guān)[30]。循環(huán)ANGPTL8與血脂水平之間的關(guān)系目前仍不一致，有待進(jìn)一步研究。

(2) ANGPTL8調(diào)節(jié)脂代謝的機(jī)制 ANGPTL8敲除小鼠，心臟和骨骼肌中的LPL活性明顯增高[31]，這表明ANGPTL8可負(fù)向調(diào)節(jié)這兩種組織中的LPL活性。ANGPTL8也是通過抑制LPL酶活性，導(dǎo)致血漿脂質(zhì)水平發(fā)生變化[31]。研究表明，ANGPTL8與LPL結(jié)合的殘基序列中，約有100個與ANGPTL4同源[3]，這提示ANGPTL8抑制LPL酶活性的機(jī)制可能與ANGPTL4相似。缺乏ANGPTL8的小鼠，LPL活性增高，血漿TG水平降低，TG清除率增加；反之，在小鼠肝臟中過表達(dá)ANGPTL8，LPL活性降低，可導(dǎo)致血清TG水平顯著增加[32]。此外，ANGPTL8的單克隆抗體(表位為E97IQVEE)中和降低了小鼠血清TG水平[31]，ANGPTL8有望成為高脂血癥的新的治療靶點(diǎn)。

4.展望 ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8蛋白在血漿脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，三者均可通過抑制LPL活性而調(diào)節(jié)體內(nèi)TG水平，而對膽固醇水平產(chǎn)生影響的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本課題組在家族性高膽固醇血癥及早發(fā)冠心病患者篩查ANGPTL3、ANGPTL4和ANGPTL8的基因變異，并探討其對膽固醇代謝和早發(fā)動脈粥樣硬化的影響及機(jī)制，以期望提供有力證據(jù)。目前，ANGPTL3單克隆抗體降低LDL-C已進(jìn)入第三臨床試驗階[33]。ANGPTL家族有望成為治療血漿脂質(zhì)代謝異常、防治冠心病的一個新的治療靶點(diǎn)。ANGPTL4和ANGPTL8是否可以在臨床上降低膽固醇以降低心血管事件的發(fā)病風(fēng)險，仍有待進(jìn)一步研究。