橡膠樹CRISPR/Cas9編輯植株出現(xiàn)預(yù)期表型的突變閾值

摘""要：本課題組前期在橡膠樹原生質(zhì)體中分別實現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9-RNP及質(zhì)粒介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化基因編輯，并以HbPDS基因為靶標(biāo)，在橡膠樹愈傷組織中實現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化基因編輯，并獲得了出現(xiàn)白化表型的愈傷組織，但由于橡膠樹愈傷誘導(dǎo)體胚的技術(shù)還不穩(wěn)定，導(dǎo)致未能獲得基因編輯植株。為了獲得橡膠樹基因編輯幼苗，本研究繼續(xù)以HbPDS基因為靶標(biāo)，改用橡膠樹體胚為侵染受體，開展農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得增殖的T0代抗性體胚，通過Cas9基因分子檢測共挑選出116個陽性轉(zhuǎn)化體胚，通過對靶點處的測序檢測發(fā)現(xiàn)有5個胚塊發(fā)生了基因編輯，編輯效率為4.3%。通過植株再生程序，獲得了2株再生植株，表型觀測均是嵌合體，表現(xiàn)為同一編輯植株上同時存在綠色及白化葉片。同時取白化葉片和綠色葉片進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)二者均已發(fā)生了基因編輯，除了1個白化葉片發(fā)生了純合雙等位突變之外，其余葉片均為嵌合突變。其中，白化葉片編輯細胞的占比介于86%～100%之間，而綠色部位編輯細胞所占比例介于66%～69%之間，說明橡膠樹CRISPR/Cas9編輯植株出現(xiàn)預(yù)期表型的突變閾值高于69%，介于70%～85%之間，為今后創(chuàng)制有表型的橡膠樹基因編輯幼苗提供理論指導(dǎo)。同時，本研究證明了T0代轉(zhuǎn)化體胚及其獲得的再生植株嵌合比例太高，不宜作為植株再生的材料，為今后通過對T0代陽性體胚進行繼代獲得T1代純合體胚，并以T1代體胚為轉(zhuǎn)化受體獲得純合基因編輯植株提供思路。本研究首次公開報道獲得了橡膠樹基因編輯植株，盡管是嵌合植株，但也增進了對CRISPR/Cas9在橡膠樹中作用的理解，為下一步在橡膠樹中改進并應(yīng)用基因編輯技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；CRISPR/Cas9；HbPDS基因；基因編輯；突變閾值中圖分類號：S794.1""""""文獻標(biāo)志碼：A

Mutant"Threshold"Capable"of"Inducing"Expected"Phenotype"in"Rubber"Tree"CRISPR/Cas9"Edited"Seedlings

YANG"Xianfeng1，2，3，4，"LIN"Qiufei1，2，"JINU"Udayabhanu1，2，3，4，"LI"Ji1，2，"QIAN"Zunchao5，"DENG"Yuting1，2，"HUANG"Tiandai1，2，3，4*

1."Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Rubber"Tree，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Haikou"Key"Laboratory"of"Innovative"Tropical"Plant"Seedlings，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"4."National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"5."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunan"665000，"China

Abstract："Previously，"we"achieved"gene"editing"using"CRISPR/Cas9-RNP"and"plasmid"in"the"PEG-mediated"protoplasts"transient"transformation"of"rubber"tree，"and"by"targeting"the"HbPDS"gene，"callus"with"albino"phenotype"were"obtained，"but"no"edited"plants"were"regenerated"because"the"technology"of"embryogenesis"from"callus"is"not"yet"mature."In"order"to"obtain"gene"edited"seedlings，"we"used"the"same"HbPDS"target"as"previous"in"the"callus"editing，"but"used"somatic"embryos"as"the"transformation"receptor"instead"of"callus."After"hygromycin"resistance"screening，"116"positive"T0"generation"embryos"were"selected"through"Cas9"gene"PCR"detection，"following"by"next"generation"sequencing，"five"embryos"were"found"to"be"edited"at"the"target，"accounting"for"4.3%"of"PCR"positive"embryos."At"last，"two"regenerated"plants"were"obtained，"both"were"chimeric"because"only"partial"albino"leaves"appeared"in"the"plantlet."Sequencing"of"both"albino"and"green"parts"revealed"that"gene"editing"had"occurred"in"all"samples，"besides"a"homozygous"biallelic"mutation"in"one"albino"leaf，"all"other"leaves"exhibited"chimeric"mutations，"with"mutant"sequences"in"albino"parts"accounting"for"86%"to"100%"ratio，"while"green"parts"accounting"for"66%"to"69%"ratio."This"indicates"that"the"mutation"threshold"inducing"the"expected"phenotype"in"rubber"tree"CRISPR/Cas9"editing"plants"is"higher"than"69%，"ranging"from"70%"to"85%，"providing"theoretical"guidance"for"obtaining"gene"editing"seedlings"with"expected"phenotype"in"the"future."Meanwhile，"it"is"proven"that"nearly"all"the"regenerated"plantlets"obtained"from"T0"generation"somatic"embryos"are"chimeric，"thus"T0"generation"embryos"are"not"suitable"as"regenerated"materials，"but"also"providing"insights"to"improve"the"regeneration"procedure"by"using"T1"embryo"to"get"homozygous"seedlings"in"the"future."This"is"the"first"report"about"gene"editing"plants"in"rubber"tree，"although"they"are"chimeric，"it"still"enhances"the"understanding"of"the"function"of"CRISPR/Cas9"in"rubber"tree，"laying"the"foundation"for"improving"and"applying"gene"editing"technology"in"rubber"tree.

Keywords："Hevea"brasiliens;"CRISPR/Cas9;"HbPDS"gene;"gene"editing;"mutation"threshold

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.001

橡膠樹原產(chǎn)于亞馬遜河流域的熱帶高大喬木，目前我國生產(chǎn)上的主栽品種均是從國外直接引進，或是用國外引進的少數(shù)骨干親本雜交后選育而成，品種間遺傳背景狹窄。另外，橡膠樹基因組高度雜合，且開花前營養(yǎng)生長周期長達5～6"a，所以常規(guī)雜交育種只能從F1代中選擇優(yōu)良單株進行初級系比、高級系比、區(qū)域試種，整個育種周期長達30"a以上，造成品種更新?lián)Q代緩慢，品種老化嚴重[1]。所以，通過生物工程手段開展分子育種，是用超常規(guī)手段打贏橡膠樹新品種培育翻身仗的必由之路。2013年出現(xiàn)的以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯系統(tǒng)是生命科學(xué)中的革命性技術(shù)，因該系統(tǒng)成本低廉、操作簡單，可以對基因組DNA特定靶點實現(xiàn)特異、高效突變，并且在T0代即可產(chǎn)生純合突變編輯植株，是對橡膠樹這種基因組高度雜合、同源基因家族眾多的物種進行遺傳改良的理想技術(shù)。目前多種植物已建立了CRISPR/Cas9基因組編輯體系并得到了廣泛應(yīng)用。相比于模式作物和大田作物，橡膠樹高質(zhì)量基因組測序于2016年才完成[2]，且沒有成熟的轉(zhuǎn)化體系。在本課題組建立較為高效的橡膠樹原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系后，直到2020年和2021年才率先分別建立了基于CRISPR/Cas9-"RNP和質(zhì)粒的橡膠樹基因編輯體系[3-4]，證明了橡膠樹活體細胞也可以發(fā)生基因編輯，且為快速鑒定候選基因編輯靶點的效率提供了篩選體系。八氫番茄紅素脫氫酶基因（Phytoene"desaturase，"PDS）是最早被分離與鑒定的類胡蘿卜素生物合成關(guān)鍵酶基因之一，它可以催化無色的八氫番茄紅素生成多種色素物質(zhì)[5]。在植物中，此基因的突變會導(dǎo)致葉綠素合成受阻，從而表現(xiàn)出白化表型，因此在多種植物中作為建立基因編輯體系的標(biāo)記基因[6-8]。為了獲得橡膠樹基因編輯植株，本課題組構(gòu)建了以HbPDS基因為靶標(biāo)，基于pCAMBIA1300的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化編輯載體，并對橡膠樹愈傷進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，但由于愈傷誘導(dǎo)體胚形成技術(shù)不穩(wěn)定，沒有得到抗性陽性體胚，因而并未得到再生編輯植株。為了獲得橡膠樹基因編輯植株，本研究直接以橡膠樹體細胞胚為轉(zhuǎn)化受體，跳過了由愈傷誘導(dǎo)體胚的障礙，大大提高了獲得基因編輯植株的概率，最終首次獲得了橡膠樹基因編輯植株，并對編輯植株的綠色及白化部位進行了分子檢測，從而得到了橡膠樹編輯植株基因型與表型的對應(yīng)關(guān)系，確定了橡膠樹CRISPR/Cas9編輯植株出現(xiàn)預(yù)期表型的突變閾值范圍，為下一步改進橡膠樹基因編輯技術(shù)及利用基因編輯技術(shù)提供借鑒。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""實驗轉(zhuǎn)化用的受體材料。橡膠樹品種Reyan73397成熟的子葉胚由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所的天然橡膠新型種植材料創(chuàng)新基地提供。初始體胚由橡膠樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)形成，并將體胚放在基于MS[9]的體胚發(fā)生培養(yǎng)基（MSE）上進行繼代，培養(yǎng)基中含有4.44"μmol/L"6-芐基腺嘌呤、13.9"μmol/L"Kinetin（KT）（下同）、1.44"μmol/L"Gibberellic酸、0.27"μmol/L"2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）、70"g/L蔗糖、50"ml/L椰子水、1"g/L木炭和2.2"g/L植酸酶。為了減少體胚繼代產(chǎn)生的隨機突變，所有體胚均傳代不超過5代。

1.1.2""菌株及載體""基因編輯載體由本課題組基于pCAMBIA1300載體構(gòu)建。其中Cas9基因用2×35S啟動子驅(qū)動，sgRNA由本課題組克隆的pHbU6.2啟動子驅(qū)動，命名為pCAMBIA1300-2×"35SCas9-HbU6.2，該載體含有雙Aar"Ⅰ酶切位點，用于插入靶標(biāo)序列。將基因編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株（上海唯地生物技術(shù)有限公司）后備用。

1.2""方法

1.2.1""生物信息學(xué)分析""香蕉、蘋果、木薯等多種植物均以PDS基因為靶標(biāo)建立了各自物種的基因編輯體系，突變植株表現(xiàn)出白化表型[7-8，"10]，因此PDS基因常被用作植物建立基因編輯技術(shù)的標(biāo)記基因。該基因在不同植物中具有很強保守性，其中木薯與橡膠樹同屬于大戟科，用以上報道植物中PDS基因的保守序列為參照，對橡膠樹基因組進行搜索（http：//hevea.catas.cn/home/index），以便預(yù)測橡膠樹中的HbPDS基因。

1.2.2""基因編輯載體構(gòu)建""首先用Aar"I（NEB）酶切pCAMBIA1300-2×35SCas9-HbU6.2質(zhì)粒，酶切體系如下：質(zhì)粒1"μg，10×buffer"5"μL，Aar"I酶1"μL，50×oligonucleotide"1"μL，補充ddH2O至50"μL，37"℃酶切5"h。載體酶切后產(chǎn)生如下粘性末端（5￠?TAGCTCTG----CAATTGCTA CTGC?3￠，3￠?ATCGAGACTTTG----ACGATGACG?5￠）合成靶標(biāo)序列，添加接頭與上述粘性末端互補，合成序列（5￠?ATTGATGAGATCCATTCTT CT G C?3￠，3￠?TACTCTAGGTAAGAAGACGCAA A?5￠，陰影部分的4個堿基為與載體酶切后互補的粘性末端）。通過T4"DNA連接酶（NEB），將酶切后的載體與靶標(biāo)序列連接，從而構(gòu)建成完整的靶標(biāo)HbPDS基因的編輯載體（圖1），掃描下方二維碼（圖2），可查看該載體的全序列及結(jié)構(gòu)。

1.2.3""橡膠樹體胚遺傳轉(zhuǎn)化""采用超聲波輔助的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法對橡膠樹體胚進行遺傳轉(zhuǎn)化[11]。先挑取1個農(nóng)桿菌單斑放入1.5"mL離心管中，22"℃，160"r/min搖床搖16"h，然后吸取20"uL菌液轉(zhuǎn)入裝有200"mL"LB的三角瓶中，加入100"μmol/L乙酰丁香酮（AS）搖至OD600=0.45，

然后放入體胚侵染8"min，接著在40"kHz的超聲波強度下處理50"s，靜止10"min，取出體胚放在滅菌濾紙上，置于超凈工作臺吹干后轉(zhuǎn)入含100"μmol/L"AS的MSE培養(yǎng)基上，在黑暗條件下22"℃共培養(yǎng)84"h。

1.2.4""陽性體胚的分子檢測""將侵染后的體胚放入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基[12]，培養(yǎng)基中添加10"mg/L潮霉素和500"mg/L特美汀，1個月后換到MSE培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2個月，取邊長2"mm的正方形胚塊按照多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，用Cas9基因特異引物（Cas9-F：5￠?CCGATCGGCACAGCATCAAG?3￠，Cas9-R：5￠?TCCACATCGCTATTGTCCGG?3￠）做PCR檢測陽性轉(zhuǎn)化體胚。擴增使用上海吐露港生物科技有限公司的2×Magic"Green"Taq"SuperMix酶，擴增體系如下：正、反向引物（10"μmol/L）各1"μL，2×Magic"Green"Taq"SuperMix"10"μL，DNA模板1"μL，ddH2O"7"μL。PCR程序如下：95"℃預(yù)變性3"min；95"℃"10"s，58"℃"10"s，72"℃"30"s，35個循環(huán)；72"℃延伸5"min，擴增子大小為433"bp。

1.2.5""植株再生""挑選1.2.4中分子檢測為陽性的體胚，轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基進行植株再生。再生培養(yǎng)基成分為在MS培養(yǎng)基中添加0.23"μmol/L"KT、0.11"μmol/L"IAA及8.7"μmol/L"GA3，植物凝膠添加量為1"g/L，蔗糖用量為50"g/L。培養(yǎng)條件為28"℃光照16"h，暗培養(yǎng)8"h。

1.2.6""編輯植株的分子檢測""分別剪取同一株再生植株上的白色、褪綠及綠色葉片，按1.2.4中的方法提取基因組DNA，接著用位于靶點兩側(cè)的特異引物（T10-F：5￠-ggagtgagtacggtgtgcCA GTC T A T G C TGGAGTTAG-3￠，T10-R：5￠-gagttggatg ct g g a t g g GCTT TGCTCTGATCTGCAG-3￠，小寫字母為二代測序接頭序列）對靶點區(qū)域進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小170"bp。將PCR產(chǎn)物送往中國水稻研究所高通量測序平臺進行二代測序[13]。

2""結(jié)果與分析

2.1""HbPDS基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)同源搜索，橡膠樹基因組中只有1個HbPDS基因，全長為23"928"bp，共有14個外顯子，開放閱讀框（open"reading"frame，"ORF）為1749"bp（圖3）。參考香蕉、木薯PDS基因的編輯靶點，在HbPDS基因的第12個外顯子上選取編輯靶點，序列為5￠?CCTGCAGAA GAATGGA T C T CA T?3￠，其中前3個陰影堿基為PAM（proto sp acer"adj acent"motif）基序。

2.2""橡膠樹體胚的侵染效率

用300個體胚進行農(nóng)桿菌侵染，1個月后在新形成的愈傷中長出了小球形胚，將該球形胚轉(zhuǎn)入體胚形成培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2個月后，切取2"mm的正方形小胚塊提取DNA，然后用Cas9特異引物做PCR擴增，結(jié)果共有116個胚塊能擴出Cas9特異基因片段（圖4），侵染效率為38.7%。

2.3""陽性轉(zhuǎn)化體胚的表型及基因型

經(jīng)高通量測序，在116個Cas9分子檢測陽性的轉(zhuǎn)化體胚中，僅有5個體胚發(fā)生了基因編輯，抗性體胚表現(xiàn)出了白化表型（圖5A），對經(jīng)植株再生獲得的萌芽狀態(tài)的子葉型胚（圖5B）進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)綠色萌芽處和白化子葉均發(fā)生了基因編輯，前者編輯細胞的比例約為70%，后者為84%（圖5C）。

2.4""編輯植株的表型及基因型

5個陽性編輯體胚最終獲得了2株基因編輯幼苗，2株苗均為嵌合體，表現(xiàn)為同一植株上既有綠色葉片，又有白化葉片（圖6A）。采集綠色和白化部位的葉片進行高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使是綠色葉片也發(fā)生了基因編輯，編輯細胞的比例介于66%～69%之間，而白色部位葉片的編輯比例介于86%～100%之間。因此，橡膠樹基因編輯植株出現(xiàn)預(yù)期表型的編輯比例閾值介于70%～"85%之間。除了其中1個白化葉片靶點處是純合雙等位突變外（圖6B），其余綠色部位和白化部位葉片的細胞均是嵌合狀態(tài)，編輯類型高達17種（圖6C）。

3""討論

本課題組前期分別以CRISPR/Cas9-RNP和質(zhì)粒的形式實現(xiàn)了橡膠樹原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化基因編輯[3-4]，但未獲得基因編輯幼苗。究其原因，還是橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系不太成熟。盡管國際上以花藥為外植體獲得了橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株[14-16]，但橡膠樹轉(zhuǎn)基因效率仍然較低。以花藥為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化存在諸多弊端：一是花藥可采集時間短，只有開花期才能獲得外植體；二是如遇到陰雨天或白粉病爆發(fā)，也難以采集到足量的花藥；三是剝花是一個相對技術(shù)難度較高又耗時費力的工作，且整個過程容易污染；四是由花藥愈傷誘導(dǎo)體胚也是一個挑戰(zhàn)，常常難以獲得足量的體胚進入下一步的植株再生步驟。

鑒于以上花藥作為遺傳轉(zhuǎn)化外植體的弊端，本課題組嘗試用次生體胚作為轉(zhuǎn)化受體，結(jié)果證實能夠獲得較好的轉(zhuǎn)化效率[11，"17]。但以體胚為受體的轉(zhuǎn)化也存在弊端，即再生部位與轉(zhuǎn)化部位往往不一致[18-19]，因此推測以體胚為受體再生的常規(guī)轉(zhuǎn)基因植株以嵌合體為主，但無法獲得證據(jù)，因為即使是嵌合體，也能檢測到T-DNA的插入及目的基因的表達。而借助對HbPDS基因開展編輯研究，首先可以從表型上觀測轉(zhuǎn)化子是否嵌合體，若肉眼區(qū)分不開，可以利用二代測序檢測轉(zhuǎn)化子細胞中是否含有野生型序列，及區(qū)分編輯序列的類型和各類型的比例。本研究證實了直接由侵染體胚→抗性愈傷→抗性體胚（T0）→植株再生過程獲得的T0代體胚及再生苗大概率都是嵌合狀態(tài)。

由本研究可知，要使HbPDS編輯植株出現(xiàn)預(yù)期白化表型，編輯細胞的比例至少要達到70%以上。所以，提高編輯細胞的比例至關(guān)重要，而只有獲得純合植株才更能保證編輯出現(xiàn)預(yù)期表型。編輯植株在局部位置也存在純合的葉片，因此推斷若是T0代陽性體胚不進行植株再生，而是將其分割為多個小胚塊，再經(jīng)歷一遍抗性愈傷誘導(dǎo)→抗性體胚誘導(dǎo)（T1）→植株再生的篩選過程，在分割成多個小胚塊后，再經(jīng)過抗性篩選就有可能分離出純合的轉(zhuǎn)化細胞，通過植株再生最終獲得純合的編輯（轉(zhuǎn)化）植株，從而提高橡膠樹轉(zhuǎn)基因或基因編輯植株出現(xiàn)預(yù)期表型的概率。

另外，在116個Cas9基因分子檢測陽性的轉(zhuǎn)化體胚中，僅有5個體胚發(fā)生了基因編輯，編輯效率僅為4.3%，說明當(dāng)前的基因編輯載體效率不高，需要優(yōu)化。本研究中Cas9基因的啟動子為2′35S，基因序列是根據(jù)水稻密碼子偏好進行的優(yōu)化[20]。已有研究證明，多種啟動子特別是植物內(nèi)源強啟動子均比35S啟動子能獲得更高的編輯效率[21-23]，下一步，本課題將用橡膠樹內(nèi)源強啟動子pHbUbiquitin[24]替換2′35S啟動子，并對Cas9基因進行橡膠樹密碼子優(yōu)化，以期提高目前編輯載體的編輯效率。

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