老年晚期非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)與酪氨酸激酶抑制劑療效的相關(guān)性

江 波 金從國(guó) 楊承綱 涂長(zhǎng)玲 朱 穎 何文杰 劉 坤

(云南省腫瘤醫(yī)院,云南 昆明 650118)

肺癌病死率居所有惡性腫瘤之首〔1〕。臨床研究顯示，無(wú)論是在治療原發(fā)病灶前還是切除原發(fā)灶后，甚至包括在治療后復(fù)發(fā)的腫瘤患者體內(nèi)都可檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)〔2,3〕。腫瘤細(xì)胞中存在表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)通路，如EGFR過(guò)度表達(dá)，EGFR突變等的異常，從而促進(jìn)細(xì)胞不斷增殖并抑制其凋亡，導(dǎo)致生長(zhǎng)調(diào)節(jié)失控〔4〕。肺癌的分子靶向治療中EGFR是目前研究最多的肺癌治療靶點(diǎn)且相應(yīng)的藥物已進(jìn)入臨床。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)已經(jīng)成為晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)一種有效的治療手段。尤其在老年患者中，EGFR-TKI相對(duì)化療具有更大的優(yōu)勢(shì)。本研究以老年晚期NSCLC為研究對(duì)象，以外周血CTC為載體，探討外周血CTC的EGFR表達(dá)水平與EGFR-TKI類藥物療效及預(yù)后之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 篩選云南省腫瘤醫(yī)院2012年9月至2014年12月收治且經(jīng)病理組織學(xué)診斷的老年晚期NSCLC患者48例為研究對(duì)象，男36例，女12例；年齡60～78(平均71歲)；病理類型：腺癌36例，鱗癌12例；TNM分期：ⅢB期6例，Ⅳ期42例；功能狀態(tài)(PS)評(píng)分0～1分36例，≥2分12例。治療前后均行胸腹部CT、彩超、顱腦MRI、心電圖、血常規(guī)、血生化及腫瘤標(biāo)志物檢查。

1.2治療方法 根據(jù)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)從以下3種EGFR-TKI中任選一種。吉非替尼片(阿斯利康公司)使用劑量為每次250 mg,口服，1次/d；厄洛替尼片(美國(guó)羅氏公司)使用劑量為每次150 mg,口服，1次/d；鹽酸?？商婺崞?浙江貝達(dá)藥業(yè)公司)使用劑量為每次125 mg,口服，3次/d。無(wú)論選擇何種藥物均至少服用1個(gè)月。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集 48例患者在治療前后均從肘正中靜脈采血5 ml,治療前隨機(jī)選取5例患者另采血20 ml，所有血液標(biāo)本加入肝素抗凝混勻，并在采集后2 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2抗體及試劑 CD45-PC5、CK18-FITC、EGFR-PE、NH4Cl溶血素，均購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司。流式細(xì)胞儀EPICS XL(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.3.3分選CD45-CK18+細(xì)胞 利用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)將5例20 ml外周血每份分成20份加入5 ml的無(wú)菌試管中，每管1 ml；每管加入CD45-PC5、CK18-FITC各200 μl，避光保存30 min;加入NH4Cl溶血素4 ml，反復(fù)溶血，直到液體透亮，離心后加入培養(yǎng)液待分選；消毒ALTRA流式室，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度8℃左右，打開(kāi)流式細(xì)胞儀，進(jìn)行分選細(xì)胞數(shù)接近1 000個(gè)結(jié)束。

1.3.4確定CD45-CK18+細(xì)胞為外周血CTC 將分選的CD45-CK18+細(xì)胞用玻片收集微球后置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察有無(wú)惡性腫瘤細(xì)胞的特征。

1.3.5CTC中EGFR的檢測(cè) 將48例治療前后的96個(gè)5 ml標(biāo)本分別加入20 μl CD45-PC5、20 μl EGFR-PE和20 μl CK18-FITC,加入肝素抗凝的全血100 μl，搖勻后避光室溫保存30 min然后加入NH4Cl溶血素2 ml溶血，15 min后上機(jī)檢測(cè)，表達(dá)CD45-CK18+的細(xì)胞為患者外周血?dú)埩舻腃TC,表達(dá)CD45-CK18+EGFR+的細(xì)胞為CTC的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4療效評(píng)價(jià) 按WHO實(shí)體瘤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)，疾病進(jìn)展(PD),CR+PR為總有效，CR+PR+SD為控制。無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)指自治療首日至病變進(jìn)展日；總生存期(OS)為自治療首日至死亡日或失訪日，均以月計(jì)算。隨訪結(jié)止2015年10月。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法,Log rank法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1確定外周血CTC 選取的5例外周血中均分選出CD45-CK18+細(xì)胞，染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，具備惡性腫瘤細(xì)胞的特征：細(xì)胞核染色加深，染色質(zhì)變粗，核質(zhì)比例增大，可確定CD45-CK18+細(xì)胞為外周血CTC，見(jiàn)圖1。

圖1 老年NSCLC患者外周血CTC(HE，×400)

2.2CTC的EGFR表達(dá)水平與臨床因素的關(guān)系 在48例治療前的標(biāo)本中，EGFR表達(dá)水平在不同性別(男23.54±11.8，女26.25±14.3)、臨床分期(ⅢB 19.65±2.0，Ⅳ 24.9±13.2)、PS評(píng)分(0～1分 26.11±13.4，≥2分 21.61±11.3)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.840,P=0.404;t=0.795、P=0.430;t=1.351,P=0.182)，EGFR表達(dá)水平在不同組織類型之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(鱗癌17.47±2.9，腺癌36.93±4.7，t=3.264,P=0.001)。

2.3CTC的EGFR表達(dá)水平與TKI療效的關(guān)系 本組48例患者中，1例CR，19例PR,9例SD,19例PD,總有效率為41.7%(20/48)，疾病控制率為60.4%(29/48)；EGFR表達(dá)值介于5.4～50，以中位數(shù)21.4作為界定值，大于中位數(shù)的定義為EGFR高表達(dá)(20例)，小于中位數(shù)的定義為EGFR低表達(dá)(28例)。EGFR高表達(dá)組(EGFR水平為35.62±13.4)的總有效率(50.0%，CR 1例，PR 9例，SD 4例，PD 6例)與低表達(dá)組(EGFR水平為 14.23±7.6)的總有效率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(35.7%，CR 0例，PR 10例，SD 5例，PD 13例，χ2=11.465,P=0.009)。EGFR高表達(dá)組疾病控制率(70.0%)與低表達(dá)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(53.6%,χ2=0.698,P=0.007)。

2.4治療前后CTC的EGFR表達(dá)水平的變化 本組48例患者中，治療有效的29例患者CTC的EGFR表達(dá)水平治療前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；治療無(wú)效的19例患者CTC的EGFR表達(dá)水平治療前無(wú)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 治療前后CTC的EGFR表達(dá)水平比較

2.5CTC的EGFR表達(dá)水平與生存期的關(guān)系 本組病例OS為15個(gè)月，1年生存率為60.6 %，2年生存率為33.3%，3年生存率為12.1%。EGFR高表達(dá)組和低表達(dá)組，中位OS分別為21個(gè)月和10個(gè)月，1年生存率分別為77.8%和63.3%；2年生存率分別為38.1%和31.2%；3年生存率分別為22.2%和3.3%。經(jīng)Log rank檢驗(yàn)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見(jiàn)圖2。本組病例中位PFS為6個(gè)月。EGFR高表達(dá)組和低表達(dá)組中位PFS分別為11個(gè)月和4個(gè)月；經(jīng)Log rank檢驗(yàn)，兩組比較差異顯著(P=0.001)，見(jiàn)圖3。

圖2 老年晚期NSCLC患者CEC EGFR表達(dá)水平與OS的關(guān)系

圖3 老年晚期NSCLC患者CEC的EGFR表達(dá)水平與PFS的關(guān)系

3 討 論

EGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族成員，在大多數(shù)NSCLC中表達(dá)上調(diào)，是治療NSCLC的一個(gè)重要靶點(diǎn)。臨床研究證實(shí)〔5～7〕，EGFR突變型患者對(duì)EGFR-TKI類藥物的有效率可達(dá)65%～83%，而野生型患者僅為10%～15%。因此，NCCN指南已把EGFR基因突變陽(yáng)性作為使用EGFR-TKI藥物的先決條件。常用的EGFR突變檢測(cè)方法有：測(cè)序法，PCR-SSCP，突變體富集PCR，ARMS，微數(shù)字PCR，HRM，DHPLC等，但每種檢測(cè)法均依賴于組織標(biāo)本〔8～10〕。目前多數(shù)NSCLC中EGFR基因突變檢測(cè)均以手術(shù)切除的肺癌組織作為研究材料，這類患者多因?qū)儆谠缙谶€未列入靶向治療的范疇，而晚期尤其老年患者很難獲得足量的組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，因此國(guó)內(nèi)外都缺乏這方面的大樣本臨床資料。Punnoose等〔11〕發(fā)現(xiàn)接受EGFR-TKI治療的NSCLC患者的CTC攜帶的基因信息與腫瘤組織具有高度一致性并證實(shí)了通過(guò)CTC檢測(cè)EGFR的可能性。

目前關(guān)于EGFR的表達(dá)是否對(duì)NSCLC靶向治療有指導(dǎo)意義仍有爭(zhēng)論，針對(duì)CTC及組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)的研究較多，但針對(duì)EGFR蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性研究的國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少。對(duì)EGFR表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等NSCLC臨床病理特征的關(guān)系也有爭(zhēng)論。本研究顯示無(wú)論是組織的蛋白突變檢測(cè)還是蛋白表達(dá)檢測(cè)均提示EGFR腺癌表達(dá)水平高于鱗癌，EGFR高表達(dá)患者的療效及疾病控制率均明顯優(yōu)于EGFR低表達(dá)的患者，說(shuō)明依據(jù)CTC的EGFR表達(dá)水平來(lái)選擇TKI類藥物是可行的，該種方法可能對(duì)于組織突變檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行的老年患者是一種有效的補(bǔ)充。本研究是以中位數(shù)作為區(qū)分高低表達(dá)的界限，對(duì)臨床TKI藥物的選擇具有一定的參考價(jià)值，且本研究還顯示CTC的EGFR變化水平可能是TKI療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

有研究〔12〕顯示EGFR蛋白表達(dá)與基因突變之間不存在一致性。但也有研究顯示服用EGFR-TKI的患者，蛋白高表達(dá)組生存期要比低表達(dá)組長(zhǎng)〔13〕。本研究表明CTC的EGFR高表達(dá)的老年患者能有更長(zhǎng)的OS及PFS。晚期NSCLC的一線治療中，有40%～50%患者能從TKI治療中獲益。如何從無(wú)法獲取組織標(biāo)本的這部分老年患者中篩選出適合TKI治療的患者是臨床醫(yī)生所面臨的問(wèn)題。本研究提示通過(guò)檢測(cè)外周血CTC的EGFR表達(dá)水平，有助于臨床篩選適合接受TKI治療的老年患者，從而提高藥物療效，避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失和減輕藥物的不良反應(yīng)。

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