結(jié)締組織生長因子在去卵巢大鼠骨丟失中的作用

劉彩云 郭 影

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是一種細胞外基質(zhì)分泌蛋白，在正常情況下，心、肝、腦、腎等組織器官中呈基礎(chǔ)量表達。CTGF作為一種重要的效應(yīng)分子表達于軟骨和骨組織，研究發(fā)現(xiàn)，CTGF在骨骼重建、骨量維持等方面起著重要作用，但尚需對其進行系統(tǒng)深入的研究，并探討臨床應(yīng)用的可行性。本實驗探討CTGF在去卵巢(OVX)大鼠骨丟失中可能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1動物模型的建立 3月齡成年雌性SD 大鼠30 只，隨機分為3組，①假手術(shù)(Sham)組、②OVX組、③OVX+雌激素(OVX+E)組，每組10只。將大鼠以10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，在無菌條件下，經(jīng)腰背部正中縱行切口進入腹腔背側(cè)，將OVX組和OVX+E組大鼠完整切除雙側(cè)卵巢，Sham組大鼠僅切除雙側(cè)卵巢下方少許脂肪組織，重量約與卵巢相同。自O(shè)VX術(shù)后7 d起，分別對各組大鼠進行灌胃給藥，共12 w。OVX+E組給予戊酸雌二醇0.833 mg·kg-1·d-1灌胃，Sham組和OVX組以10 ml/kg體重給予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液，1次/d。給藥劑量按體重每周校正一次。

1.2骨密度(BMD)測定 各組處理12 w后，雙能X線骨密度儀測量各組每只大鼠雙側(cè)股骨及腰椎BMD，每只測量3次取平均值。BMD值用g/cm2表示。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色觀察 各組動物處死后，立即無菌操作取左側(cè)股骨，固定后的組織分置于40 g/L多聚甲醛中4℃后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，脫蠟，分別行HE染色，免疫組織化學(xué)染色光學(xué)顯微鏡下觀察各組組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1股骨BMD表達比較 與Sham組相比，OVX組BMD明顯下降(P<0.05)，OVX+E組BMD無明顯差別(P>0.05)；與OVX組相比，OVX+E組、Sham組BMD增加(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠骨密度比較

與Sham組相比:1)P<0.05；與OVX組相比:2)P<0.05

2.2骨組織學(xué)觀察 與Sham 組大鼠比較，OVX 組大鼠骨小梁稀疏、斷裂，無網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可見大量小梁盲端，骨小梁數(shù)目減少，間距增寬。OVX+E組大鼠骨組織形態(tài)與Sham組基本相似。見圖1。

2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 CTGF 陽性信號主要位于骨小梁周邊的軟骨細胞、成骨細胞及骨髓腔中，以骨髓腔中脂肪細胞外基質(zhì)居多〔1〕。與Sham組(0.041 3±0.003 8)相比，OVX 組骨小梁周邊CTGF陽性細胞數(shù)明顯增多且表達增強，平均光密度值為0.065 0±0.003 6；而OVX+E組骨小梁周邊CTGF微量表達(0.049 7±0.006 2)。見圖2。

圖1 骨組織學(xué)觀察(HE染色)

圖2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

2.4相關(guān)性分析 OVX組大鼠骨組織中，CTGF表達與左股骨BMD呈負相關(guān)(r=-0.636,P<0.05)；OVX+E組和Sham組大鼠骨組織中，CTGF表達與左股骨BMD無明顯相關(guān)性(r=-0.572,P>0.05；r=-0.423,P>0.05)。

3 討 論

卵巢萎縮或卵巢切除術(shù)后，其功能將降低甚至消失，導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平急劇下降，骨的吸收大于骨的形成，故骨代謝出現(xiàn)明顯的負平衡，骨量將迅速流失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。而OVX大鼠正確模擬了女性雌激素下降引起的骨質(zhì)疏松，它的病變過程、病理改變和轉(zhuǎn)歸與臨床上絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)極為相似，故大鼠是最普遍、最成熟的PMOP動物模型。PMOP以骨量減少為特點,BMD的測定是最直接、最明確的判定手段之一，可反映骨質(zhì)疏松程度，是判斷造模是否成功的主要指標(biāo)。

在骨代謝中，成骨細胞與破骨細胞相互協(xié)調(diào)，使骨形成與骨吸收保持動態(tài)平衡，骨質(zhì)不斷更新。當(dāng)此協(xié)調(diào)失衡，骨吸收大于骨形成時，即發(fā)生骨質(zhì)疏松。成骨細胞是骨形成的重要細胞，起源于多能的骨髓間充質(zhì)干細胞。研究表明，CTGF的過度表達可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移、增殖，并向成骨細胞分化〔2〕。在成骨細胞中，CTGF 的表達主要通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白和 Wnt 信號通路，已有研究證實 CTGF 的 CR 域與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、BMP-4 結(jié)合，C-末端結(jié)構(gòu)域與 Wnt受體結(jié)合，CTGF 綁定 BMP-2、BMP-4 抑制成骨細胞活性，模仿了 BMP拮抗劑的作用〔2〕。 Nozawa等〔3〕在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)，CTGF的過度表達導(dǎo)致成骨細胞的標(biāo)記基因在成骨細胞和基質(zhì)細胞表達下降，抑制成骨細胞功能。Wang等〔4〕發(fā)現(xiàn)CTGF過度表達可促進間葉細胞來源的成骨細胞系的分化，誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)、堿性磷酸酶形成以及骨鈣蛋白在間葉細胞中的表達。CTGF 通過 αvβ1 整合素增強成骨細胞黏附，通過對細胞骨架的重組和 Rac1 的激活促進成骨細胞分化〔5〕。破骨細胞是參與骨吸收最主要的細胞，在骨重建中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松骨質(zhì)流失的重要媒介。CTGF可促進體外培養(yǎng)的破骨細胞前體細胞增殖，促進其分化為成熟多核破骨細胞，激活破骨細胞的骨吸收功能〔6〕。但在破骨細胞上未檢測到CTGF的表達，而小鼠CTGF基因敲除后能顯著抑制破骨樣細胞的形成〔7〕。有研究表明，17β-雌二醇可由 PKA 介導(dǎo)下調(diào)人成骨細胞 CTGF 表達〔8〕。Mundy等〔9〕在實驗研究中發(fā)現(xiàn) CTGF 持續(xù)過度表達會降低成骨細胞的成熟與礦化。本研究結(jié)果顯示,OVX可使CTGF蛋白表達增加，而雌激素可能抑制CTGF表達。相關(guān)分析也提示OVX大鼠骨組織中伴隨CTGF表達增強，BMD下降，且雌激素能阻止CTGF的過度表達。綜上所述，CTGF 在OVX大鼠骨丟失發(fā)病機制中可能起到重要作用，提示其存在潛在的應(yīng)用價值，尤其在病理狀態(tài)下有希望作為一種分子靶向藥物應(yīng)用于臨床。

1Wanq W,Strecker S,Liu Y,etal.Connective tissue growth factor reporter mice label a subpopulation of mesenchymal progenitor cells that reside in the trabecular bone region〔J〕.Bone,2015；71(1):76-88.

2Smerdel-Ramoya A，Zanotti S，Stadmeyer L，etal.Skeletal overexpression of connective tissue growth factor impairs bone formation and causes osteopenia〔J〕.Endocrinology,2008;149(9):4374-81.

3Nozawa K，F(xiàn)ujishiro M，Kawasaki M，etal．Connective tissue growth factor promotes articular damage by increased osteoclastogenesis in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Res Ther,2009;11:R174.

4Wang JJ,Ye F,Cheng LJ,etal.Osteogenic differentiation of mesench-ymal stem cells promoted by overexpression of connective tissue growth factor〔J〕.Zhejiang Univ Sci B,2009;10(5):355-67.

5Hendesi H,Barbe MF,Safadi FF,etal.Integrin mediated adhesion of osteoblasts to connective tissue growth factor (CTGF/CCN2)induces cytoskeleton reorganization and cell differentiation〔J〕.PLoS One,2015;10(2):e0115325.

6張 麗,姜麗燕,張良巖.CTGF 對破骨前體細胞 RAW264.7 增殖及碳酸酐酶Ⅱ分化的影響〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志,2014;20(2):133-6.

7Canalis E,Zanotti S,Beamer WG,etal．Connective tissue growth factor is required for skeletal development and postnatal skeletal homeostasis in male mice〔J〕．Endocrinology,2010;151(8):3490-501.

8隋國良,彭依群,翟木緒.17β-雌二醇下調(diào)人成骨細胞 CTGF 表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志,2006;12(5):443-6.

9Mundy C,Gannon M,Popoff SN,etal.Connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)negatively regulates BMP-2 induced osteoblast different-iation and signaling〔J〕.J Cell Physiol,2014;229(5):672-81.