白藜蘆醇對認知功能損傷大鼠腦組織凋亡蛋白表達的影響

唐 明 趙 欣 魏興軍 楊長路

(天津永久醫(yī)院急診科，天津 300450)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，表現(xiàn)為學習、記憶能力的下降〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)導致老年人認知功能障礙的危險因素包括心血管疾病、中年高膽固醇血癥、代謝綜合征等因素〔2,3〕。研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦內(nèi)凋亡相關蛋白的表達水平發(fā)生變化，提示AD患者的認知功能與凋亡蛋白相關。白藜蘆醇是從葡萄、虎杖等植物中提取的一種多酚類素質(zhì)，具有抗凋亡、抗腫瘤及保護心血管等作用〔5,6〕。本文探討白藜蘆醇對AD大鼠的抗凋亡機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級Wistar大鼠5只作為對照組，早老素(PS)1/淀粉樣前體蛋白(APP)雙轉基因大鼠10只隨機均分為AD組和白藜蘆醇組，動物購自中國科學院動物研究所。

1.2藥品及儀器 白藜蘆醇購自西安百川生物科技有限公司，一抗caspase-3、 Bax 和 Bcl，IgG二抗均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3樣品制備 生理鹽水、多聚甲醛快速灌注，立即取腦，左腦固定于4%的多聚甲醛，右腦存放于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4免疫組織化學染色法檢測大鼠腦組織caspase-3、 Bax 和 Bcl蛋白表達 70%酒精3 h→95%酒精3 h→95%酒精過夜→100%酒精脫水2次→透明(二甲苯)→浸蠟→切片(5 μm)→烤箱過夜→二甲苯脫蠟3次→脫水→抗原修復→血清封閉→滴加一抗過夜→加二抗→顯色；Western印跡法檢測caspase-3、 Bax 和 Bcl蛋白的表達水平，取出腦組織→加入磷酸鹽緩沖液(PBS)超聲波破碎→離心5 min(12 000 r/min)→取上清→十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳→電轉→封閉2 h→一抗4℃孵育過夜→二抗孵育1 h→二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.5統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行ANOVA分析。

2 結 果

2.1免疫組織化學檢測結果 AD組caspase-3和Bax陽性表達較對照組增強且數(shù)目顯著增加，Bcl陽性表達顯著減弱(P<0.05)；白藜蘆醇組caspase-3和Bax陽性表達顯著降低，Bcl陽性表達顯著增強(P<0.05)。見圖1。

2.2Western印跡檢測結果 AD組較對照組腦組織內(nèi)caspase-3、 Bax蛋白水平顯著升高，Bcl蛋白水平顯著下降(P<0.05)，白藜蘆醇組caspase-3、 Bax蛋白水平顯著降低，Bcl蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖2和表1。

圖1 各組腦組織caspase-3、Bax、Bcl表達免疫組織化學染色結果(DAB，×30)

圖2 各組腦組織caspase-3、Bax、Bcl蛋白表達

組別caspase?3BaxBcl對照組0．0048±0．0010．1071±0．0100．1903±0．025AD組0．1317±0．0311)0．2726±0．0151)0．0879±0．010白藜蘆醇組0．0516±0．0082)0．0931±0．0112)0．3164±0．0282)

與對照組比較：1)P<0.05；與AD組比較：2)P<0.05

3 討 論

目前，AD的發(fā)病機制尚不明了，隨著醫(yī)學進步，醫(yī)學學術界出現(xiàn)了以下學說：神經(jīng)遞質(zhì)代寫障礙、β-淀粉樣蛋白、基因、金屬離子、神經(jīng)細胞凋亡等學說〔7～9〕。caspase家族是凋亡相關蛋白，當線粒體收到損傷，線粒體通透性轉換開放，細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，從而引起caspase級聯(lián)反應，促進細胞凋亡〔10〕。Bcl是凋亡抑制基因，腦組織中Bcl蛋白表達水平降低將促進神經(jīng)細胞凋亡。本文提示白藜蘆醇可能通過下調(diào)促凋亡蛋白caspase-3、 Bax的水平和上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl水平調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白表達改善AD大鼠的認知功能。

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