阿托伐他汀鈣聯(lián)合七葉皂甙鈉對(duì)自身免疫性腦脊髓炎大鼠血清炎癥因子水平及脊髓內(nèi)病變的影響

張瑞彪 羅永偉 石秋艷

(唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)分泌科，河北 唐山 063200)

多發(fā)性硬化(MS)的主要病理過(guò)程表現(xiàn)為自體免疫反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)軸突損傷及神經(jīng)纖維髓鞘脫失等。我們已通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠脊髓內(nèi)病灶數(shù)及血清炎性因子水平的研究，證實(shí)高劑量阿托伐他汀鈣對(duì)EAE大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用〔1～4〕，但高劑量阿托伐他汀鈣因其副作用，臨床應(yīng)用受到一定限制。本文觀察低劑量阿托伐他汀鈣聯(lián)合七葉皂甙對(duì)EAE 大鼠脊髓內(nèi)病灶數(shù)及神經(jīng)功能評(píng)分、白細(xì)胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6～8周齡健康，清潔級(jí)雌性Wistar大鼠70只，體重180～210 g。全部購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。健康，清潔級(jí)豚鼠10只，雌雄各半，365～385 g，全部購(gòu)自溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2動(dòng)物模型制備 每只豚鼠于腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛4 ml，成功麻醉后處死，于冰上剝離脊膜，取出脊髓，按1∶1比例加入生理鹽水，冰槽內(nèi)用超聲細(xì)胞粉碎儀制成 50%全脊髓勻漿，加入等量含4%卡介苗的完全弗氏佐劑充分混合至油包水乳劑，乳化后于2 h內(nèi)按0.5 ml/只于大鼠四足皮下注射，用來(lái)誘發(fā)EAE大鼠模型。

1.3試劑提供 阿托伐他汀鈣由大連輝瑞制藥有限公司提供。七葉皂甙由山東綠葉制藥公司生產(chǎn)。IL-2、TNF-α試劑盒購(gòu)自上海天呈生物技術(shù)有限公司。完全弗氏佐劑由美國(guó)Sigma公司提供；卡介苗購(gòu)自北京生物制品研究所。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 70只Wistar大鼠經(jīng)過(guò)造模成功后隨機(jī)分成EAE組10只、阿托伐他汀組20只、七葉皂甙組20只，阿托伐他汀聯(lián)合七葉皂甙組(聯(lián)合組)20只，后三組按照時(shí)間順序再細(xì)分成2個(gè)亞組，即14和21 d組，每亞組10只大鼠。造模成功后當(dāng)日阿托伐他汀組予阿托伐他汀鈣2 mg/kg，于每日清晨8點(diǎn)灌胃治療1次，七葉皂甙組予七葉皂甙5 mg/kg，腹腔注射。聯(lián)合組予阿托伐他汀鈣3 mg/kg每日清晨8點(diǎn)灌胃治療，每日1次。七葉皂甙5 mg/kg腹腔注射，每日1次。EAE組于同時(shí)間段予溫開(kāi)水灌胃及生理鹽水腹腔內(nèi)注射，直至動(dòng)物處死。

1.5神經(jīng)功能評(píng)分 通過(guò)觀察大鼠癥狀及行為表現(xiàn)，Wistar大鼠EAE模型神經(jīng)功能評(píng)分采用五分評(píng)定法：1分：大鼠尾部無(wú)力下垂或無(wú)法挺立；2分：雙后肢無(wú)力，行走困難；3分：雙后肢完全癱瘓，不能行走；4分：四肢完全癱瘓；5分：動(dòng)物處于瀕死狀態(tài)或死亡?！?分者為造模成功。

1.6病理標(biāo)本制作 各組造模成功大鼠給予相應(yīng)治療及安慰劑后，觀察動(dòng)物行為，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后于第14、21天分別處死。10%水合氯醛3～5 ml腹腔麻醉后斷頭處死，冰上迅速完整剝離脊髓，石蠟封片包埋處理，每25 μm連續(xù)切片后行常規(guī)HE染色。

1.7IL-2及TNF-α水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后即刻采集心血2 ml，3 000 r/min離心后獲取血清，-40℃冰箱保存。IL-2及TNF-α測(cè)定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法，由實(shí)驗(yàn)室工作人員嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。同時(shí)取大鼠腰髓切片在顯微鏡下計(jì)數(shù)每張片內(nèi)隨機(jī)5個(gè)高倍視野病灶數(shù)，取平均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件進(jìn)行χ2及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)癥狀評(píng)分及死亡情況 造模成功后，各組均于6～13 d發(fā)病，部分大鼠癥狀呈進(jìn)展性加重，少數(shù)病情緩解后復(fù)發(fā)，部分大鼠死亡。聯(lián)合組神經(jīng)癥狀評(píng)分及死亡情況明顯輕于阿托伐他汀組、七葉皂甙組及EAE組，同日神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于單獨(dú)用藥組(P<0.05)，發(fā)病率及死亡率亦明顯低于單獨(dú)用藥組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)癥狀評(píng)分及死亡情況

與EAE組比較：1)P<0.05；與阿托伐他汀組及七葉皂甙組比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組血清炎性因子及脊髓內(nèi)病灶數(shù)比較 發(fā)病后14 d EAE組血清IL-2、TNF-α水平明顯高于各治療組(P<0.05)，發(fā)病21 d上述炎性因子較14 d時(shí)有所降低，但仍高于各治療組(P<0.05)，且聯(lián)合組炎性因子水平明顯低于單獨(dú)用藥組(P<0.05)。各用藥組脊髓內(nèi)病灶于14 d后明顯增多，到21 d病灶又逐漸減少，兩個(gè)時(shí)間段均明顯低于EAE組(P<0.05)，且聯(lián)合組明顯低于單獨(dú)用藥組(P< 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清IL-2、TNF-α水平及脊髓內(nèi)病灶數(shù)比較

3 討 論

有研究報(bào)道，鹽酸法舒地爾等藥物通過(guò)調(diào)節(jié)Rho/ROCK系統(tǒng)，能有效緩解MS癥狀〔5,6〕。隨后，又有研究指出，法舒地爾等藥物因給藥途徑、用藥劑量及副作用等，在其臨床應(yīng)用中受到限制〔7〕。同時(shí)，多種湯劑及中藥提取物治療MS模型大鼠有效，但中藥因提純及具體有效成分、具體作用機(jī)制等未明〔8,9〕。在EAE發(fā)病過(guò)程中，目前普遍認(rèn)為CD4+Th1細(xì)胞起到了主要的介導(dǎo)作用，且免疫相關(guān)因子核因子(NF)-κB在疾病的發(fā)生、發(fā)展及炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用〔10〕。七葉皂苷鈉在分子結(jié)構(gòu)上含有酚羥基，因而具有與維生素E類似的自由基清除、血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉可以通過(guò)清除氧自由基和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而保護(hù)神經(jīng)組織〔11〕。因七葉皂苷鈉具有很強(qiáng)的穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和清除自由基的作用，特別對(duì)毒性最強(qiáng)的羥自由基，通過(guò)阻斷自由基連鎖反應(yīng)，降低其毒性并經(jīng)歧化作用解毒。同時(shí)，七葉皂苷鈉有利于神經(jīng)組織微循環(huán)的恢復(fù)，提高血漿超氧化物歧化酶活性，增強(qiáng)其抗自由基能力，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。有報(bào)道其對(duì)彌漫性腦組織損傷及神經(jīng)系統(tǒng)水腫有治療作用，其機(jī)制可能與其抗氧化、抗炎、抑制毒性細(xì)胞因子釋放有關(guān)〔12〕，目前被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科臨床。阿托伐他汀作為最有效的他汀類調(diào)脂藥物之一，可有效調(diào)控血脂，同時(shí)改善患者認(rèn)知能力〔13〕。在EAE發(fā)病高峰期，血清各種炎癥因子，如TNF-α，IL-2等水平明顯增高，造成血腦屏障的損傷，進(jìn)一步加強(qiáng)神經(jīng)纖維的脫髓鞘改變〔14〕。研究證明高劑量阿托伐他汀可能是通過(guò)抑制EAE大鼠Th1細(xì)胞，阻斷類異戊二烯中間代謝產(chǎn)物的生成，進(jìn)而減少I(mǎi)L-2和TNF-α等炎癥因子的水平，從而維持Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡〔1～4〕。但大劑量阿托伐他汀鈣造成的肝損傷、肌病、橫紋肌溶解癥等，嚴(yán)重的限制了其在臨床廣泛應(yīng)用〔15,16〕。本實(shí)驗(yàn)研究提示低劑量阿托伐他汀聯(lián)合七葉皂甙可通過(guò)抑制血清炎癥因子水平，進(jìn)一步減輕神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥反應(yīng)，對(duì)EAE大鼠有一定的治療作用，其效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。

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