ROCK1在大鼠腦缺血再灌注致細(xì)胞凋亡中的作用

蔣國紅 王長明 徐 平 張金菊 劉海軍 魏志杰 張 麗

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

缺血再灌注可引起機(jī)體多種器官損傷，尤其是腦組織，該損傷產(chǎn)生的機(jī)制比較復(fù)雜，確切機(jī)制仍未完全明了。Rho/Rho相關(guān)的卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機(jī)體內(nèi)存在的一種與細(xì)胞的生長、增殖和分化有關(guān)的信號通路，在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中起重要作用，現(xiàn)在更多的關(guān)注于其在腦缺血再灌注損傷中的作用。ROCK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分為ROCK1和ROCK2兩種亞型。ROCK1可通過激活下游線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其具體分子機(jī)制仍有待研究〔1〕。ERK1/2作為MAPK信號通路中一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)了諸如物質(zhì)代謝、細(xì)胞運動、能量活動及炎癥反應(yīng)等一系列機(jī)體生命活動〔2〕。而ROCK1在腦組織缺血環(huán)境下誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡是否與ERK1/2信號通路存在關(guān)聯(lián)，二者關(guān)系如何？本研究擬探討ROCK1通路在腦組織細(xì)胞凋亡過程中的作用和可能的機(jī)制，以期為腦缺血引起的相關(guān)疾病治療提供新思路和方法。

1 材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑 SPF級成年雄性SD大鼠〔體重(200±20)g〕42只，購自中山大學(xué)實驗動物中心；法舒地爾(Fasudil)購自Sigma公司；總RNA分離試劑盒、SYBR Premix EX Taq Ⅱ Kit購自TaKaRa公司；GAPDH、ROCK1、ERK1/2、pERK1/2抗體購于Santa Cruz公司。

1.2實驗動物分組及大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制作 將實驗動物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、灌注組1 d、灌注組3 d、灌注組7 d和灌注+法舒地爾組。Zea-longa改良線栓法〔3〕制作MCAO模型：水合氯醛麻醉后，仰臥固定，頸部正中1 cm切口，鈍性分離暴露雙側(cè)頸總動脈，凝斷頸內(nèi)外動脈之間的交通動脈及頸外動脈的甲狀腺上動脈分支，結(jié)扎頸外動脈的遠(yuǎn)端，并燒斷殘端。動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈殘端剪一小切口，將末端沾有硅膠的魚線從頸總動脈近分叉處緩慢插入頸內(nèi)動脈，有輕微抵觸感(插入深度大約為18 mm)時停止，取開頸總動脈的動脈夾，進(jìn)行栓塞。栓塞2 h后拔出，恢復(fù)腦血液灌流。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈但不插線，其他同缺血組大鼠。正常組不做處理，常規(guī)飼養(yǎng)。灌注+法舒地爾組手術(shù)過程同灌注組，手術(shù)后6、12、24 h時腹腔注射5 mg/kg的法舒地爾各1次，共3次。取假手術(shù)組和灌注組1 d大鼠腦組織行TTC染色鑒定，標(biāo)準(zhǔn)：麻醉清醒后右側(cè)出現(xiàn)Horner征，左側(cè)出現(xiàn)肢體神經(jīng)功能缺損，將Zea-longa評分1～3分者作為有效觀察對象。

1.3熒光定量PCR 利用RNA分離試劑盒提取總RNA，用DNase I對RNA進(jìn)行處理。GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物：ROCK1上游：AGCATCATGTCGACTGGGGA，下游：ACCAAAGCATCCAATCCATCC；bcl-2上游：5'-GGCATCTGCACACCTGGAT-3'，下游：5'-ATCAAA-CAGAGGTCGCATGCT-3'；bax上游：5'-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3'，下游：5'-TCTCCCCAGCCATCCTCTCT-3'；caspa-se-3上游：5'-AGTGGAGGCCGACTTCCTGTA-3'，下游：5'-TGGCGCAAAGTGACTG-3'；GAPDH上游：5'-AGGG-CTGCCTTCTCTTGTGA-3'，下游：5'-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3'。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green熒光染料法，用delta-delta C(t)的方法進(jìn)行分析。

1.4Western印跡 取適量組織，加入蛋白裂解液后低溫研磨，4℃離心取上清，BCA定量法測定總蛋白濃度，12% SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵育GAPDH、ROCK1、ERK1/2、pERK1/2一抗，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠/山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色、曝光后洗片。

2 結(jié) 果

2.1MCAO模型的制作 大鼠腦組織TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織染后是紅色的，而模型組的梗死區(qū)是白色的。模型組的左側(cè)肢體神經(jīng)功能缺損，右側(cè)出現(xiàn)Horner征，Zea-Longa評分都在1～3分。見圖1。

2.2各組ROCK1、bax、bcl-2、caspase-3基因表達(dá)的變化 與正常組相比，假手術(shù)組的ROCK1、bax、bcl-2、caspase-3 mRNA含量變化不明顯(P>0.05)。與正常組相比，灌注組的Rock1、bax、caspase-3 mRNA表達(dá)在1 d時逐漸升高，在3 d時達(dá)到高峰，之后表達(dá)量開始下降；而bcl-2 mRNA表達(dá)量正相反，1 d開始降低，3 d時最低，之后開始回升。與正常組相比，灌注組各目標(biāo)基因mRNA表達(dá)變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。灌注+法舒地爾組ROCK1基因被抑制，其表達(dá)量與灌注組相比明顯下降，caspase-3及bcl-2基因mRNA含量同樣下降，bax呈上升趨勢(P<0.05，P<0.01)。

圖1 大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

2.3各組ROCK1、ERK1/2及pERK1/2蛋白水平變化 SD大鼠腦缺血再灌注損傷后ROCK1蛋白水平變化與基因水平一致，1 d顯著上升，到3 d時達(dá)到峰值，7 d出現(xiàn)下降。相同時間點，ERK1/2蛋白含量沒有明顯改變，但pERK1/2含量在1 d顯著上升，到3 d時達(dá)到峰值，7 d出現(xiàn)下降。注射ROCK1抑制劑法舒地爾后，與灌注組相比，ROCK1蛋白得到抑制，表達(dá)量降低；ERK1/2蛋白表達(dá)量未發(fā)生明顯改變，但pERK1/2蛋白表達(dá)明顯上升。見圖2，圖3。

1：正常組；2：假手術(shù)組；3～5：灌注組1 d、3 d、7 d圖2 缺血再灌注后ROCK1、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達(dá)結(jié)果

1：正常組；2：假手術(shù)組；3：灌注組3 d；4：灌注+法舒地爾組圖3 ROCK1抑制后ROCK1、ERK1/2及pERK1/2蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討 論

Rho亞家族蛋白通過一系列下游效應(yīng)分子發(fā)揮各種生物學(xué)功能，其中，ROCK1是最重要的下游效應(yīng)分子之一，Rho/ROCK1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要介導(dǎo)細(xì)胞骨架重組、張力絲和黏著斑形成、血管重塑、基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡等。研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血再灌注后RhoA 蛋白表達(dá)增高，抑制RhoA表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長及神經(jīng)功能的修復(fù)。Yagita等〔5〕研究P-內(nèi)收蛋白(adducin)表達(dá)變化評價ROCK的活性，發(fā)現(xiàn)在腦缺血后6 h，P-adducin含量顯著上升，同時腦微循環(huán)出現(xiàn)障礙；通過ROCK抑制劑抑制ROCK活性后微循環(huán)獲得明顯改善，提示腦缺血可引起ROCK激活，進(jìn)而影響腦微循環(huán)過程。也有學(xué)者認(rèn)為ROCK1信號通路還涉及腦缺血引起的炎癥反應(yīng)及參與血腦屏障的破壞〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK1通路參與了變異性心絞痛、心衰、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病及動脈粥樣硬化等相關(guān)疾病，ROCK1的調(diào)控在疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，bax、bcl-2、caspase-3均為細(xì)胞凋亡調(diào)控基因。caspase-3通過切割下游效應(yīng)分子，激活相關(guān)信號通路進(jìn)而導(dǎo)致凋亡發(fā)生。bcl-2/bax作為抗/促凋亡基因，都可作為caspase-3的上游調(diào)控基因，bax過度表達(dá)能活化下游caspase-3蛋白酶，介導(dǎo)細(xì)胞的存活或死亡，bcl-2可與bax形成二聚體抑制bax活性〔8〕。檢測bax、bcl-2、caspase-3的表達(dá)改變，可預(yù)期細(xì)胞凋亡情況。本研究提示腦缺血再灌注損傷后，細(xì)胞凋亡被啟動。但隨著時間推移，相關(guān)抗凋亡活動也產(chǎn)生作用，保護(hù)細(xì)胞生存。ROCK1與調(diào)控細(xì)胞凋亡基因一樣在缺血再灌注腦組織中表達(dá)發(fā)生明顯改變，提示ROCK1可能參與了缺血再灌注所致的細(xì)胞凋亡過程，影響凋亡的發(fā)生和發(fā)展。缺血再灌注損傷后，ERK1/2可被活化，通過激活其下游分子caspase-3發(fā)揮作用〔9〕。ERK1/2可能通過bax和P53作用于線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，敲低bax表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。ERK1/2活化促進(jìn)bax表達(dá)與寡聚化，引起線粒體膜電勢下調(diào)；抑制bax活性下調(diào)表達(dá)與寡聚化〔10〕。ERK1/2與ROCK1是兩條影響腦缺血后細(xì)胞功能的重要信號途徑，越來越受研究關(guān)注，但是二者之間具體調(diào)控機(jī)制不是很明了。本研究結(jié)果提示，ROCK1可能參與了缺氧致腦細(xì)胞凋亡的過程，其過程可能與ERK1/2信號通路有關(guān)。但二者之間是否存在某種關(guān)聯(lián)？目前發(fā)現(xiàn)的ROCK1抑制劑中應(yīng)用最廣泛的法舒地爾是異喹啉磺酰胺衍生物類抑制劑，它和它體內(nèi)的代謝產(chǎn)物羥基法舒地爾都可以阻斷ROCK1〔11〕。本研究采用注射ROCK1抑制劑法舒地爾后，ROCK1基因被抑制，其表達(dá)量與灌注組相比明顯下降，caspase-3及bcl-2基因mRNA含量同樣下降，bax則呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，與灌注組相比，ROCK1蛋白得到抑制，表達(dá)量降低；ERK1/2蛋白表達(dá)量未發(fā)生明顯改變，但pERK1/2蛋白表達(dá)明顯上升。提示，抑制ROCK1后，ERK1/2磷酸化加強，激活的ERK1/2使得促凋亡分子的表達(dá)與活性增強，細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，本研究表明，ROCK1可負(fù)調(diào)控ERK1/2磷酸化，ERK1/2可能作為ROCK1信號通路下游效應(yīng)分子，共同參與了缺血后腦組織細(xì)胞的凋亡過程。

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