針刺聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的作用

史 華 何 琦 婁元俊 邵素菊

(河南省中醫(yī)院兒童腦病康復(fù)科，河南 鄭州 450002)

缺血性腦卒中通常由于腦動(dòng)脈狹窄或栓塞，使得局部腦血流量突然減少或中斷，導(dǎo)致局部腦組織血氧以及能量供應(yīng)不足，引起血管內(nèi)皮繼發(fā)性損傷及自主神經(jīng)功能障礙〔1,2〕。由于成熟后的中樞神經(jīng)如遭到損傷，幾乎失去再生能力，而神經(jīng)的再生(包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化、神經(jīng)軸突分化發(fā)芽、突觸可塑性的改變)是缺血性腦卒中后神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵之一，因此，如何減少神經(jīng)再生抑制因子以及促進(jìn)神經(jīng)再生及重塑在腦缺血性腦卒中患者的治療中顯得十分重要〔3,4〕。研究者發(fā)現(xiàn)，針灸、康復(fù)訓(xùn)練、周圍環(huán)境的刺激與神經(jīng)再生密切相關(guān)，針灸治療腦缺血性腦卒中有著良好的療效，及時(shí)有效的介入治療能有效地減輕后遺癥的發(fā)生，改善腦梗死，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)，有效的康復(fù)訓(xùn)練也被廣泛應(yīng)用于改善患者腦梗死后的多種神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)功能障礙〔5～8〕。本文擬探討針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，6月齡左右，體質(zhì)量250～280 g,由河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK(豫)2016-0009。河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。溫度20℃～26℃,濕度45%～70%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有大鼠不限飼料及水，術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.2試劑與儀器 戊巴比妥鈉，北京普博斯生物進(jìn)口分裝；powerlab電生理記錄儀，AD instruments，BX51 型 Olympus 顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3模型復(fù)制 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠仰臥于固定板上固定，去除頸部手術(shù)開(kāi)口區(qū)域被毛，碘酒、酒精消毒，頸部選取正中位置進(jìn)行1～2 cm的手術(shù)開(kāi)口，鈍性分離頸部皮下組織與肌肉，在左側(cè)頸內(nèi)三角處暴露頸總動(dòng)脈，然后小心將頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)分離，鈍性分離頸內(nèi)外動(dòng)脈，用電凝器將頸外動(dòng)脈的分支燒斷并使其凝固，頸外動(dòng)脈游離約5 mm，將頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用4號(hào)手術(shù)絲線結(jié)扎，頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈用止血夾夾閉以阻止血流，于頸外動(dòng)脈近心端剪一切口以便插入線栓(直徑0.26 mm)，4號(hào)手術(shù)絲線于切口處打一活結(jié)，松開(kāi)夾持在頸內(nèi)動(dòng)脈上的止血夾，沿頸總動(dòng)脈將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，使其到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部(18～20 mm)，將頸外動(dòng)脈切口處的活結(jié)扎緊，松開(kāi)止血夾，逐層縫合皮膚。

1.4分組與治療 130只大鼠進(jìn)行造模，從模型復(fù)制成功的大鼠中選取80只隨機(jī)分為模型組、針刺+康復(fù)組、針刺組、康復(fù)訓(xùn)練組，每組20只；假手術(shù)組20只，除不插入線栓外，其余操作與手術(shù)組相同。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行針刺治療穴位定位及操作，選取百會(huì)、風(fēng)府。以大鼠局部輕顫為度，留針20 min。針刺第1天在模型手術(shù)術(shù)后4 h實(shí)施，置于標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)。康復(fù)訓(xùn)練組干預(yù)方式：將大鼠置于豐富環(huán)境籠中飼養(yǎng)，籠中額外添加彩球、玩具、滾筒及積木，每天將環(huán)境設(shè)置變換1次。模型復(fù)制手術(shù)完成24 h 后開(kāi)始進(jìn)行康復(fù)，康復(fù)過(guò)程中播放舒緩音樂(lè)。針刺+康復(fù)訓(xùn)練組采用的針刺方法與針刺組相同，并在此基礎(chǔ)上增加與康復(fù)訓(xùn)練組相同的康復(fù)訓(xùn)練方法。

1.5大鼠神經(jīng)行為評(píng)分 分別在治療后3、7、14 d進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)分。根據(jù)Berderson評(píng)分法標(biāo)準(zhǔn)：(1)提起大鼠尾巴，前肢屈曲，0分：雙前肢對(duì)稱伸向地面，1分：手術(shù)的對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈，2分：肘屈曲，3分：肩內(nèi)旋，4分：腕肘屈曲且肩內(nèi)旋。(2)大鼠置于無(wú)障礙平整地面上，推動(dòng)一側(cè)肩部向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查阻力，0分：雙側(cè)阻力對(duì)等且有力，阻力下降的程度分為輕、中、重三級(jí)，計(jì)為1，2，3分。(3)雙前肢的肌張力評(píng)分，0分：大鼠雙前肢置于金屬網(wǎng)上，雙前肢肌張力對(duì)等且有力，手術(shù)對(duì)側(cè)肢張力下降程度分為輕、中、重三級(jí)，計(jì)為1，2，3分。當(dāng)發(fā)現(xiàn)大鼠向一側(cè)不停轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分。分?jǐn)?shù)高，代表大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

1.6對(duì)腦電活動(dòng)的影響 于14 d治療干預(yù)1 h后檢測(cè)腦電活動(dòng)。戊巴比妥麻醉，將大鼠俯臥固定，顱頂去毛，沿正中開(kāi)口2 cm，暴露顱骨，于矢狀縫兩側(cè)旁開(kāi)2 mm處鉆孔，將作用電極插入孔內(nèi)；參比電極插于鼻根部，用Powerlab描記腦電圖,計(jì)算腦電活動(dòng)強(qiáng)弱，用平均波幅(μV)表示。

1.7TTC染色檢測(cè)大鼠腦組織梗死面積 于14 d治療干預(yù)1 h后，戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭，冰浴低溫將腦部整體取下，-20℃中放置20 min后，從額極開(kāi)始每2 mm作一切片，整個(gè)腦部可以得到連續(xù)的6個(gè)切片，用1%TTC溶液在避光環(huán)境中進(jìn)行染色，37℃孵育20 min，然后用10%多聚甲醛進(jìn)行固定，24 h后將腦組織切片進(jìn)行拍照，Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)量照片上不著色部分面積(缺血部分不著色)，該區(qū)占整個(gè)腦組織切片面積的百分比(%)即為大鼠腦組織梗死率。

1.8對(duì)腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響 于14 d治療干預(yù)1 h后，戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取左側(cè)大腦視交叉前后2 mm冠狀切片組織塊置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，切片厚度3～4 μm，HE染色，于LEICA DMLB型光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。半定量評(píng)價(jià)腦組織損傷，鏡下將腦組織損傷程度分為0～3級(jí)(0級(jí)為0分，1級(jí)為1分，2級(jí)為2分，3級(jí)為3分)，級(jí)別越高損傷程度越嚴(yán)重。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件，計(jì)量資料組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)行為評(píng)分結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)行為評(píng)分在第3、7、14天均顯著增加(P<0.01)；第3、7天，與模型組比較，針刺組、康復(fù)訓(xùn)練組、針刺+康復(fù)組大鼠神經(jīng)行為評(píng)分顯著減少(P<0.05)；第14天，針刺組、康復(fù)組、針刺+康復(fù)組大鼠神經(jīng)行為評(píng)分顯著減少(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 針刺+康復(fù)治療對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)行為評(píng)分的影響

與模型組比較：1)P<0.01；2)P<0.05

2.2腦電活動(dòng)檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組〔(64.56±8.03)μV〕相比，模型組大鼠腦電的平均波幅〔(29.39±3.24)μV〕顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，針刺組〔(41.11±3.15)μV〕與康復(fù)訓(xùn)練組〔(40.14±3.87)μV〕大鼠腦電的平均波幅顯著增加(P<0.05)，針刺+康復(fù)組大鼠腦電的平均波幅〔(48.36±3.10)μV〕顯著增加(P<0.01)。

2.3腦組織梗死面積檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)%〕相比，模型組大鼠腦梗死面積比〔(27.64±2.21)%〕顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，針刺組〔(19.31±2.05)%〕與康復(fù)訓(xùn)練組〔(20.06±3.15)%〕大鼠腦梗死面積比顯著減少(P<0.05)，針刺+康復(fù)組大鼠腦梗死面積比〔(16.32±2.16)%〕顯著減少(P<0.01)。

2.4腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果 假手術(shù)組：未見(jiàn)腦組織異常,神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無(wú)病理改變，病變?cè)u(píng)分為0分；模型組：神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，損傷嚴(yán)重,大腦皮質(zhì)見(jiàn)有灶狀缺血區(qū)，淡染，組織結(jié)構(gòu)紊亂，病變?cè)u(píng)分為6.8分；針刺組：見(jiàn)神經(jīng)組織壞死、液化形成的圓形或卵圓形，多見(jiàn)核固縮及空泡樣變，病變?cè)u(píng)分為5.9分；康復(fù)訓(xùn)練組，神經(jīng)組織壞死、液化形成的圓形或卵圓形，多見(jiàn)核固縮及空泡樣變，病變?cè)u(píng)分為5.4分；針刺+康復(fù)組：神經(jīng)元排列致密，損傷較輕，結(jié)構(gòu)較完整，病變?cè)u(píng)分為4.8分。見(jiàn)圖1。

2.5腦組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分結(jié)果 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)分〕比較，模型組病理評(píng)分值〔(7.20±0.48)分〕顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，針刺組〔(5.42±1.02)分〕與康復(fù)訓(xùn)練組〔(5.20±1.11)分〕病理評(píng)分分值減小(P<0.05)，針刺+康復(fù)組病理評(píng)分〔(4.81±1.02)分〕顯著減少(P<0.01)。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

缺血性腦卒中早期出現(xiàn)遲緩性偏癱，隨著脊髓休克的恢復(fù)，肌張力低下的狀態(tài)得到逐漸恢復(fù)，但會(huì)伴有特殊的異常的運(yùn)動(dòng)模式〔9,10〕。這種情況是由于上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-錐體束受損后未能恢復(fù)，而表現(xiàn)為上肢肩關(guān)節(jié)活動(dòng)受限制而內(nèi)旋、前臂內(nèi)收等，而下肢表現(xiàn)如髖關(guān)節(jié)伸展以及膝關(guān)節(jié)伸展而踝關(guān)節(jié)內(nèi)翻等〔11,12〕。國(guó)內(nèi)外常用Berderson評(píng)分法對(duì)神經(jīng)行為進(jìn)行評(píng)判以評(píng)估神經(jīng)的損傷程度，分?jǐn)?shù)越高代表動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。腦電波是反映腦功能的客觀指標(biāo)，是大腦活動(dòng)時(shí)皮質(zhì)細(xì)胞群之間電信號(hào)傳遞形成的電位差產(chǎn)生的細(xì)胞外電流〔13～15〕。缺血性腦卒中后由于局部血流量減少，病灶局部腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生病理性改變，影響突觸后電位的釋放，神經(jīng)興奮性降低，反映在腦電波活動(dòng)的平均波幅呈下降趨勢(shì)。局局部缺血會(huì)引起多種能量依賴性的離子通道發(fā)生功能失調(diào)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放紊亂、蛋白合成障礙、細(xì)胞膜合成障礙、多種內(nèi)平衡被擾亂，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，神經(jīng)元壞死凋亡，引起多種神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)功能障礙〔16,17〕。本研究結(jié)果顯示，針刺與康復(fù)訓(xùn)練結(jié)合治療缺血性腦卒中，可有效改善腦部局部的組織損傷，增強(qiáng)神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

1林梅琴,柳維林.針灸治療腦卒中患者偏癱步態(tài)療效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)〔J〕.康復(fù)學(xué)報(bào),2015;25(1):54-62.

2Chen X,Wang K.The fate of medications evaluated for ischemic stroke pharmacotherapy over the period 1995-2015〔J〕.Acta Pharm Sin B,2016;6(6):522-30.

3姜迎萍,周益凡,王 波,等.H-MRS 頭針結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦梗死恢復(fù)期研究〔J〕.康復(fù)學(xué)報(bào),2016;26(1):10-3.

4許丙海,時(shí)國(guó)臣,何 鳳,等.針刺百會(huì)穴和風(fēng)府穴治療缺血性腦卒中后輕度認(rèn)知功能損害的臨床研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2012;40(2):116-7.

5劉 啟,李夢(mèng)醒,劉 芳,等.針刺聯(lián)合豐富康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦缺血損 傷大鼠神經(jīng)功能及 NGF、BDNF 表達(dá)的影響〔J〕.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016；39(1):1-5.

6孔 妍.針康法對(duì)腦缺血大鼠 Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響〔J〕.針灸臨床雜志,2013;29(5):63-5.

7唐 強(qiáng),朱路文,邢艷麗,等.針康法對(duì)腦缺血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及 GAP-43、Nogo-A 表達(dá)的影響〔J〕.針灸臨床雜志,2015;31(1):54-7.

8Pernet V,Schwab ME.The role of Nogo-A in axonal plasticity,regrowth and repair〔J〕.Cell Tissue Res,2012;349(1):97-104.

9Yang JP,Liu HJ,Yang H,etal.Therapeutic time window for the neuroprotective effects of NGF when administered after focal cerebral ischemia〔J〕.Neurol Sci,2011;32(3):433-41.

10Zhou D,Fang T,Lu LQ,etal.Neuroprotective potential of cerium oxide nanoparticles for focal cerebral ischemic stroke〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci,2016;36(4):480-6.

11Liang LJ,Yang JM,Jin XC.Cocktail treatment,a promising strategy to treat acute cerebral ischemic stroke〔J〕? Med Gas Res,2016;6(1):33-8.

12Zhang LD,Wang Z,Li L,act.Effect of eye acupuncture on the expression of Brain derived neurotrophic factor in hippocampus in rats with cerebral ischemia reperfusion injury〔J〕.World J Acupunc Moxibustion(WJAM),2012;22(2):38-42.

13Moyanova SG,Dijkhuizen RM.Present status and future challenges of electroencephalography-and magnetic resonance imaging-based monitoring in preclinical models of focal cerebral ischemia〔J〕.Brain Res Bull,2014;102(1):22-36.

14Abend NS,Dlugos DJ,Clancy RR.A review of long-term EEG monitoring in critically ill children with hypoxic-ischemic encephalopathy,congenital heart disease,ECMO,and stroke〔J〕.J Clin Neurophysiol,2013;30(2):134-42.

15Finnigan S,van Putten MJ.EEG in ischaemic stroke:quantitative EEG can uniquely inform(sub-)acute prognoses and clinical management〔J〕.Clin Neurophysiol,2013;124(1):10-9.

16Yang ZX,Chen PD,Yu HB,etal.Research advances in treatment of cerebral ischemic injury by acupuncture of conception and governor vessels to promote nerve regeneration〔J〕.J Chin Integrative Med,2012;10(1):19-24.

17Jin J,Kang HM,Park C.Voluntary exercise enhances survival and migration of neural progenitor cells after intracerebral haemorrhage in mice〔J〕.Brain Injure,2010;24(3):533-40.