納米αFe2O3對牙髓干細胞增殖及骨向分化和礦化能力的影響

夏 陽 陳慧敏 胡姝穎 孫劍飛 章非敏,3 顧 寧,3

(1東南大學江蘇省生物材料與器件重點實驗室, 南京 210009)(2南京醫(yī)科大學口腔疾病研究江蘇省重點實驗室, 南京 210029)(3蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心, 蘇州 215123)

赤鐵礦型氧化鐵(αFe2O3)是最簡單的鐵氧化物,廣泛存在于自然界中.它是室溫下最穩(wěn)定的鐵氧化物,不易腐蝕,不會被氧化或還原,具有無毒、價格低廉、耐候性良好、抗腐蝕能力強等特點,在氣體傳感、催化、醫(yī)藥等領(lǐng)域應用廣泛.此外,它還是一種重要的半導體材料,在光催化降解環(huán)境污染物、光解水制氫以及鋰離子電池領(lǐng)域有廣泛的應用.

近年來,隨著對αFe2O3納米材料應用研究的深入,其相關(guān)的生物學性質(zhì)研究也引起了廣泛關(guān)注.例如,Zhang等[1]研究了不同粒徑納米αFe2O3對Caco-2細胞的吸附和毒性效應,發(fā)現(xiàn)粒徑對納米顆粒與細胞之間的吸附行為具有顯著影響.Bhattacharya等[2]研究了納米級和微米級αFe2O3顆粒對人肺細胞的毒性.目前,筆者尚未查閱到關(guān)于納米αFe2O3對多潛能分化干細胞增殖和成骨分化影響的研究報道.相關(guān)研究大都圍繞著氧化鐵的另一種晶型——磁赤鐵礦(γFe2O3)展開.γFe2O3因其獨特的磁學性能在磁共振成像檢測、生物醫(yī)學、組織工程等領(lǐng)域應用廣泛.文獻[3-4]指出,一定濃度的納米γFe2O3對骨髓基質(zhì)干細胞和牙髓干細胞無毒性,不影響其存活、增殖及成骨分化能力.因此,需要研究納米αFe2O3對多潛能分化干細胞的作用,以比較不同晶型和磁學性質(zhì)的納米鐵對細胞的作用效果,探索其對細胞的作用機制,以更好地開發(fā)納米鐵在生物醫(yī)學和組織工程領(lǐng)域內(nèi)的應用.

本文制備了二巰基丁二酸(DMSA)包裹的納米αFe2O3,采用透視電鏡(TEM)觀察其形貌,利用振動樣品磁強計(VSM)檢測其磁學性質(zhì),并研究了納米αFe2O3對人牙髓干細胞活力、增殖和成骨分化的影響.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人牙髓間充質(zhì)干細胞(humane dental pulp stem cells hDPSCs)由美國馬里蘭牙學院Pro Xu Hockin惠贈;αFe2O3和二巰基丁二酸(DMSA)購自中國阿拉丁公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰酶購自美國GBICO公司;CCK-8購自美國恩佐生化公司;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自日本和光純藥工業(yè)株式會社;蛋白定量試劑盒Pierce BCA Protein Assay Kit購自美國賽默飛世爾公司;細胞熒光染料購自美國英杰生命技術(shù)有限公司;青/鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、地塞米松、抗壞血酸、茜素紅購自美國Sigma公司.使用儀器包括日本電子株式會社的JSM-840型掃描電鏡、美國MolecularDevices公司的SpectraMax M5型酶標儀、日本電子株式會社的JEOL-7100型透射電子顯微鏡以及美國Lake Shore Cryotronics公司的Lakeshore 7470型振動樣品磁強計.

1.2 αFe2O3的表面處理和形貌表征

將納米αFe2O3稀釋至約1 g/L,調(diào)節(jié)pH值為2.7,加入反應瓶中.稱取鐵質(zhì)量1/4的DMSA,超聲溶解于DMSO溶液中,然后加入Fe2O3溶液中攪拌反應5 h.反應結(jié)束后離心洗滌樣品,將溶液裝入透析袋中,用透析夾夾住袋口,放入裝有雙蒸水的燒杯中,攪拌24 h.透析后即可得到穩(wěn)定的DMSA/αFe2O3膠體水溶液.利用TEM觀察其形貌,采用振動樣品磁強計測量其磁性.

1.3 實驗分組

細胞培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基和骨向誘導培養(yǎng)基.細胞形貌和增殖實驗中采用完全培養(yǎng)基,配方為DMEM培養(yǎng)基+體積分數(shù)10%的血清+體積分數(shù)1%的青霉素/鏈霉素;細胞分化實驗中采用骨向誘導培養(yǎng)基,即在完全培養(yǎng)基中添加地塞米松、抗壞血酸、維生素D、β-甘油磷酸鈉.細胞培養(yǎng)時將培養(yǎng)基作為對照組,αFe2O3培養(yǎng)基作為實驗組,其中αFe2O3在培養(yǎng)基中的濃度為10 μg/mL.

1.4 細胞增殖測定

細胞以每孔5 000個接種于96孔板中,于37 ℃,包含體積分數(shù)為5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng).在接種后的第1,4,7,14 d,每孔加入包含體積分數(shù)10% CCK-8的培養(yǎng)基孵育.培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后,從各孔中吸取液體滴入96孔板中,于酶標儀上波長450 nm處檢測其吸光度值.

1.5 細胞形態(tài)檢測

細胞接種4 d后,將細胞浸沒于熒光染料中后,在37 ℃孵箱中孵育15 min,然后用熒光顯微鏡檢測死活細胞情況和細胞鋪展狀況.

1.6 堿性磷酸酶活性檢測

在2種培養(yǎng)基中細胞培養(yǎng)14 d后,進行ALP檢測.從孵箱中取出96孔板,采用PBS漂洗3遍,每孔加入50 μL體積分數(shù)為0.25%的TritonX-100,置于37 ℃孵箱中2 h.然后加入100 μL反應底物,再置于37 ℃孵箱中2 h,利用酶標儀于波長405 nm處測量吸光度.將測得的吸光度值除以蛋白定量檢測值后進行統(tǒng)計分析,以排除不同細胞數(shù)對ALP值的影響.

1.7 茜素紅染色

細胞培養(yǎng)21 d后,進行鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色和定量檢測.hDPSC經(jīng)成骨誘導21 d,PBS清洗后,采用體積分數(shù)為1%的福爾馬林固定30 min,質(zhì)量分數(shù)為2%的茜素紅染色30 min,PBS清洗后拍照.然后,采用質(zhì)量分數(shù)為10%的氯化十六烷基吡啶溶液溶解礦化物,利用酶標儀于550 nm波長下檢測吸光度.

1.8 統(tǒng)計學分析

所有定量數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0進行獨立樣本t檢驗.每種細胞實驗重復4次,結(jié)果以“均數(shù)±標準差”的形式表示,以p<0.05表示存在統(tǒng)計學差異.

2 結(jié)果與分析

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,制備的αFe2O3呈棒狀,尺寸約10 nm×90 nm,顆粒之間單分散(見圖1).αFe2O3的形貌有納米棒、顆粒、多面體以及由多面體組裝的立方體,不同的制備方法和制備條件會產(chǎn)生不同形貌的αFe2O3[5].由此,可實現(xiàn)對納米αFe2O3尺寸和形貌的可控合成[6-7].材料的尺寸、結(jié)構(gòu)、組成、孔隙度和形貌對其性能產(chǎn)生不同的影響.在對細胞的作用上,材料尺寸、表面電荷和組成成分都會影響納米粒子的細胞攝取[8-9].

圖1 TEM照片

室溫下通過VSM測得樣品的磁滯回線,結(jié)果見圖2.由圖可知,制備的αFe2O3沒有磁性,因此,可以排除磁性作用導致其產(chǎn)生的細胞效應.來自于磁性材料的剩磁作用可影響細胞的增殖和分化[10].

圖2 αFe2O3顆粒的VSM檢測結(jié)果

選用含納米αFe2O3的完全培養(yǎng)基與牙髓干細胞共培養(yǎng),納米αFe2O3的濃度為10和100 μg/mL.細胞在αFe2O3培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后,沒有檢測到表示死細胞的紅色熒光影像.表示活細胞的綠色熒光圖片顯示,在10 μg/mL αFe2O3培養(yǎng)基和正常培養(yǎng)基對照組中,大量活細胞都已經(jīng)完全鋪展,呈現(xiàn)出典型的長梭狀,細胞形貌與細胞密度無顯著差異(見圖3(a)和(b)).但是在100 μg/mL納米αFe2O3的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)的細胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化(見圖3(c)).如圖4所示,在4個檢測時間點處,10 μg/mL αFe2O3培養(yǎng)基組與正常培養(yǎng)基對照組的細胞增殖結(jié)果之間均沒有顯著差異(p>0.05).但當納米αFe2O3在培養(yǎng)基中的濃度達到100 μg/mL時,細胞增殖受到顯著抑制,這與圖3(c)顯示的該濃度αFe2O3培養(yǎng)基對細胞形態(tài)的影響一致.當濃度為5,10,50 μg/mL時,則沒有檢測到這種不良作用.究其原因在于,高濃度下暴露出的鐵顆粒內(nèi)核可以催化產(chǎn)生ROS,激活氧化還原敏感性JNK信號通路[11],從而促進細胞凋亡[12].因此,選用質(zhì)量濃度為10 μg/mL的納米αFe2O3培養(yǎng)基進行后續(xù)的細胞成骨分化檢測.

(a) 正常培養(yǎng)基

(b) 10 μg/mL納米αFe2O3 培養(yǎng)基

(c) 100 μg/mL納米αFe2O3 培養(yǎng)基

圖4 CCK-8檢測細胞增殖結(jié)果

本研究中主要檢測了ALP活性和礦化物形成量這2個細胞成骨分化指標.骨向誘導10 d后,2組細胞的ALP 活性分別為(0.89±0.15)和(1.68±0.20) mU/mg 蛋白.由結(jié)果可知,第2組細胞的ALP活性較對照組明顯提高(p<0.01).骨向誘導21 d后,檢測2組中細胞的礦化物形成量,結(jié)果見圖5.由圖可知,第2組細胞染色更深,礦化結(jié)節(jié)更厚.定量檢測結(jié)果顯示,2組細胞的礦化物相對形成量分別為1.0±0.11和3.45±0.29,即第2組細胞的礦化物形成量較對照組明顯提高(p<0.01).

(a) 培養(yǎng)基

(b) 10 μg/mL納米αFe2O3培養(yǎng)基

納米材料對干細胞成骨分化的作用受納米材料種類和濃度影響.文獻[13-15]指出,不同種類和濃度的超順磁性氧化鐵納米材料與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng),所得結(jié)果各不相同.關(guān)于αFe2O3對牙髓干細胞這種多潛能分化干細胞成骨分化影響的研究較少.文獻[13]指出,納米γFe2O3對骨髓干細胞成骨分化的促進作用與MAPK通路有關(guān).本研究中的體外成骨分化實驗結(jié)果表明,10 μg/mL的納米αFe2O3對牙髓干細胞成骨分化有促進作用.

3 結(jié)論

1) 一定濃度的納米αFe2O3對牙髓干細胞的形態(tài)和增殖沒有影響.

2) 納米αFe2O3可以對牙髓干細胞的成骨方向分化起到促進作用.

3) 本研究結(jié)果將為納米αFe2O3在生物醫(yī)學、骨組織工程等領(lǐng)域內(nèi)的應用提供理論依據(jù)并奠定基礎(chǔ).

4) 下一步工作是使用普魯士藍染色,同時利用TEM檢測細胞對納米αFe2O3的攝入及納米αFe2O3在細胞內(nèi)的分布情況,并在基因和蛋白水平進一步驗證納米αFe2O3對牙髓干細胞成骨分化的影響.

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