多個品種微型月季快速繁殖體系的建立

張小雪,薛巖晟,姚振

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

微型月季(Rosahybrida)是由中國小月季、多花月季以及小姐妹型月季雜交育成的，較其他五類群現(xiàn)代月季而言，微型月季具有株型矮小、花形緊湊、耐寒能力強、開花時間長等特點，是一類具有很大發(fā)展?jié)摿Φ氖覂?nèi)家居裝飾花卉。作為一種微型花卉資源，微型月季的市場開發(fā)前景廣闊，它可以用于地被綠化、花壇花籬的構(gòu)建，還可陳設(shè)于花架、布置于假山之上等。目前在國外，盆栽微型月季已經(jīng)進入工廠化生產(chǎn)階段，但我國在這方面的工作剛剛起步。目前月季的繁殖技術(shù)依舊沿襲了傳統(tǒng)的扦插、嫁接等方法，這些方法限制了月季的繁殖量，不能滿足月季工廠化大生產(chǎn)發(fā)展的需要。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、速度快、成本低等特點，可以在短時間內(nèi)獲得大量的商品苗，對于推廣新品種、迅速占領(lǐng)市場具有重要的意義。早在1980年，Hasegawa[1]以攀援月季“Improved fire”的莖尖或休眠芽為材料，在MS培養(yǎng)基上建立了試管苗無性系，開辟了月季組培的先河。近年來，微型月季的組織培養(yǎng)研究越來越多。沈國正等[2]以6個盆栽微型月季品種為試驗材料進行離體培養(yǎng)，以誘導腋芽增殖為繁殖途徑獲得了微型月季的再生植株。于冰沁[3]和劉義存[4]利用帶芽(腋芽)莖段為外植體直接進行離體培養(yǎng)，建立了微型月季的快速繁殖體系。本研究以22個微型月季品種為試材，探討微型月季品種間在腋芽萌動、叢生芽增殖、生根培養(yǎng)等方面的差異，旨在建立微型月季組培快繁體系，為微型月季的組培工廠化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

22個不同品種微型月季取自長江大學園藝園林學院花卉基地，編號為R1～R22；花色有藍、橙、粉、白、黃、紅、橘紅、桃紅、玫紅、復色等。

1.2 無菌體系的建立及叢生芽誘導

從健康的植株上剪取發(fā)育良好的枝條為外植體，用自來水沖洗干凈，表面滅菌條件為 75%乙醇浸泡45s，0.1% HgCl2溶液表面消毒8～10min，無菌水沖洗5次后用濾紙吸干。滅菌后將莖段置于誘導培養(yǎng)基:MS+ 6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L，添加蔗糖30g/L、瓊脂 8g/L，pH調(diào)至5.8。30d后記錄叢生芽誘導情況、污染情況。

1.3 叢生芽增殖培養(yǎng)

選取R4、R5、R8、R15、R17、R18、R19的無菌芽，接種于叢生芽誘導培養(yǎng)基中，每個品種設(shè)3個重復，每個重復20個無菌芽(長勢、大小基本一致)，6-BA濃度設(shè)計4個水平，培養(yǎng)基分別為：①MS+ 6- BA 0mg/L+NAA 0.3mg/L；②MS+ 6- BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L；③MS+6- BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L；④MS+6- BA 5.0mg/L+NAA 0.3mg/L。培養(yǎng)30d后統(tǒng)計苗高、增殖倍數(shù)、生長狀況等指標。

1.4 生根培養(yǎng)

選用5個品種(R4、R5、R8、R15、R17)進行生根培養(yǎng)，4種激素組合如下：①1/ 2 MS+ NAA 0.1mg/L；②1/ 2 MS+NAA 0.5mg/L；③1/2 MS+IAA 0.1mg/L；④1/2 MS+IAA 0.5mg/L。每處理植株20棵，重復3次。

1.5 移栽與成苗

當組培苗根系長達1～3cm時，取出幼苗移栽到泥炭土基質(zhì)中，澆水使基質(zhì)保持濕潤，覆蓋塑料薄膜保持濕度，7d后逐漸揭膜通風透氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 微型月季品種間叢生芽誘導的差異

不同的品種在誘導培養(yǎng)基下的叢生芽誘導效率表現(xiàn)出很大的差異(表1)。有9個品種良好，叢生芽的增殖速度快，生長勢較強，植株健康，占供試品種總數(shù)的41%；有7個品種表現(xiàn)一般，生長勢也一般，植株健康，但叢生芽的增殖速度緩慢，不能達到生產(chǎn)上的需求，占供試品種總數(shù)的32% ；有6個品種表現(xiàn)較差，生長勢較弱，植株呈淺黃色，叢生芽的獲得極為困難，占供試品種總數(shù)的27%。

表1 微型月季不同品種的叢生芽誘導難易程度和誘導狀態(tài)

2.2 不同濃度6-BA對微型月季叢生芽增殖效果的影響

從圖1可以看出，當NAA濃度為0.3mg/L、不添加6-BA時，植株表現(xiàn)為莖節(jié)伸長，葉片增大，基部容易產(chǎn)生大量愈傷組織，平均株高為1.8cm，增殖倍數(shù)為0.6。添加6-BA后，當其濃度為1.0mg/L時，植株表現(xiàn)為莖節(jié)粗壯而直立，葉色濃綠，平均株高為1.6cm，增殖倍數(shù)為2.0，誘導率可達100%。隨著6-BA濃度的繼續(xù)增加，分化率不斷降低。當6-BA濃度為5.0mg/L 時，植株表現(xiàn)為莖細長而瘦弱，平均株高為1.9cm，增殖倍數(shù)為0.7，誘導率僅達到20%。

圖1 不同6-BA濃度下微型月季品種R4叢生芽的增殖狀態(tài)

2.3 不同品種微型月季試管苗的生根能力比較

試管苗接種到生根培養(yǎng)基上，5～7d開始長出新根，經(jīng)45d培養(yǎng)后，生根狀態(tài)基本穩(wěn)定。添加了0.1mg/L IAA和0.5mg/L NAA培養(yǎng)基的生根情況最好，生根率分別達到42%和43%，根長平均分別為1.7cm和1.1cm(表2)。在所有的生根培養(yǎng)基中，生根率均沒有超過50%。

表2 生根激素對微型月季生根的影響

微型月季各品種的生根率差異顯著(表3)。品種R5雖然苗的生長狀態(tài)差，但其生根率以及每個叢生芽的生根條數(shù)達到最高，分別為75%和2.1條；品種R4苗的生長狀態(tài)最好，但其生根率以及每個叢生芽的生根條數(shù)達到最低，分別為31%和0.6條；品種R8和R15苗的生長狀態(tài)一般，生根率以及每個叢生芽的生根條數(shù)分別為32%、0.6條和41%、1.8條。品種R17在4種生根培養(yǎng)基上的生長勢均較差，組培苗幾乎全部死亡。

表3 不同品種微型月季組培苗的生根率

3 討論與結(jié)論

1)據(jù)報道，叢生芽的增殖主要依靠細胞分裂素和生長素的配合誘導，隨著6-BA濃度的提高(1～3mg/L)，叢生芽的增殖系數(shù)也相應(yīng)提高，6-BA和NAA 的組合基本可以滿足誘導叢生芽的要求[5～9]。本研究中，近一半的供試品種可以完成無菌體系的建立和叢生芽誘導。微型月季除了品種間叢生芽誘導效率的差異，無菌體系建立和叢生芽誘導體系初步建立過程中遇到的問題還表現(xiàn)在內(nèi)生菌和黃化2個方面。內(nèi)生菌表現(xiàn)為前期叢生芽的生長狀態(tài)良好，植株健壯，葉色濃綠，隨著繼代次數(shù)的增加，叢生芽的根部位置會出現(xiàn)奶白色的不規(guī)則菌落，從而導致叢生芽的生長速度減慢和葉片變黃。張作梅[10]的研究表明，有些植物種類的內(nèi)生菌污染發(fā)生頻率較高，成為組培試驗失敗的一個重要原因。內(nèi)生菌是指生活在植物組織內(nèi)的微生物，用于區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌。由于植物導管直徑大于細菌100倍以上，細菌完全能夠通過外植體導管進入到外植體內(nèi)部，成為外植體的內(nèi)生菌，引起接種后的組培苗污染?？刹捎靡种拼胧┲饕校孩偻庵搀w材料預處理；②接種后勤檢查，及時檢出污染的和轉(zhuǎn)移未污染的外植體；③可在培養(yǎng)基中加入防腐劑和抗生素以及醫(yī)用殺菌劑混合物等措施進行抑制[11,12]。黃化表現(xiàn)為叢生芽對培養(yǎng)基的極度不適，健壯的叢生芽接種于培養(yǎng)基后，會出現(xiàn)植株瘦弱、下部葉片發(fā)黃和頂端發(fā)褐等現(xiàn)象，直至最后枯死。目前黃化的根本原因尚無定論，可能與材料的切割、激素的逐漸積累等原因有關(guān)?？朔参锝M織培養(yǎng)中叢生芽黃化現(xiàn)象發(fā)生，主要是及時地切割叢生芽，切割時應(yīng)盡可能減小傷口面積，并縮短切口暴露在空氣中的時間。切口過大易使細胞受損，酚類化合物外溢，因酚類化合物很不穩(wěn)定，在酶的催化下迅速氧化而形成褐色醌類物質(zhì)，進一步與組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導致整個組織代謝紊亂甚至死亡。

2)激素濃度配比是月季叢生芽增殖的關(guān)鍵。孫堅紅等[13]報道，6個不同的微型月季供試品種適宜的培養(yǎng)基有所不同。閆海霞等[14]研究表明，低濃度的6-BA有利于芽的增殖，高濃度對芽增殖有抑制作用，適宜的NAA濃度有利于芽和葉生長，偏高則會產(chǎn)生大量愈傷組織，不利于側(cè)芽的直接分化和生長。馮歡等[6]的研究表明，6-BA濃度的增大使所形成的愈傷組織致密且含水量低，不利于再分化。沈國正等[15]報道微型月季的腋芽在單獨使用6-BA的培養(yǎng)基上均能誘導芽的萌發(fā)，低濃度(0.25～0.5mg/L)有利于提高芽的萌發(fā)率，較高濃度有利于誘導叢芽，并且以1.0～1.5mg/L為最佳。冷肖荀等[16]的研究表明,6-BA的最適濃度為 2.0～2.5mg/L，低于2mg/L時，分化能力差，分化時間長；當6-BA為3mg/L時，一部分苗呈水浸狀。本研究中，6-BA在微型月季叢生芽增殖中也起著關(guān)鍵的作用。

3)微型月季組培苗的生根不同于其他組培苗的生根，幼嫩的叢生芽不易生根，與田間扦插的插穗相似，組織太嫩不易生根，而半木質(zhì)化的插穗更易生根[17]。因此壯芽培養(yǎng)是必須的，經(jīng)過壯芽培養(yǎng)來提高叢生芽的木質(zhì)化程度，再進行生根培養(yǎng)才能達到較高的生根率。此外，生根培養(yǎng)上的表現(xiàn)差異，可能與不同品種的遺傳背景不同有關(guān)。生根后的組培苗經(jīng)過煉苗移栽，生長狀態(tài)與扦插苗無明顯的區(qū)別。

4)引進的微型月季品種，在花色、花形及適應(yīng)性等方面有差異，離體培養(yǎng)中在無菌體系建立時間長短、試管苗成活率、叢生芽增殖及生根能力等方面均有不同。研究各種基因型微型月季的無菌體系建立和叢生芽誘導頻率的差別，以提高微型月季組織培養(yǎng)效率，節(jié)約組培成本，對于早日實現(xiàn)微型月季種苗工廠化生產(chǎn)具有重要意義。

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[編輯] 余文斌