重組剛地弓形蟲(chóng)GRA10蛋白的表達(dá)純化與鑒定

楊諶

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

申邦

(農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種呈世界性分布的專(zhuān)性寄生于溫血?jiǎng)游锏捻攺?fù)門(mén)寄生原蟲(chóng)。1908年,Nicolle和Manceaux首次在剛地梳祉鼠的肝脾單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了弓形蟲(chóng)的無(wú)性生殖階段——速殖子,根據(jù)此蟲(chóng)寄生的宿主名稱(chēng)和速殖子的形態(tài),將其命名為“剛地弓形蟲(chóng)”。弓形蟲(chóng)專(zhuān)門(mén)寄生在有核細(xì)胞內(nèi),其中間宿主普遍而且無(wú)特異性,可以感染所有的哺乳動(dòng)物,也包括人,引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界大約有25%～50%的人感染弓形蟲(chóng),甚至在歐洲的一些地區(qū),弓形蟲(chóng)的感染率達(dá)到80%[1]。因此，需要快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法用于該病的防控。

目前檢測(cè)弓形蟲(chóng)病主要有病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法。病原學(xué)診斷方法主要有直接涂片或組織切片染色、動(dòng)物接種分離弓形蟲(chóng)病原。免疫學(xué)方法主要有染色試驗(yàn)(Dye Test，TD)、間接血凝試驗(yàn)(Indirect Hemagglutination Test，IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、間接熒光抗體試驗(yàn)(Indirect Fluorescent Antibody Test,IFA)、親和素-生物素-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Avidin Biotin Peroxidase Complex Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ABC ELISA)和免疫膠體金技術(shù)(Immune Colloidal Gold,ICG)等。分子生物學(xué)診斷方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)?？偟膩?lái)看,目前診斷弓形蟲(chóng)病的方法較多，這些傳統(tǒng)的病原診斷方法雖然操作簡(jiǎn)單，但檢出率比較低，容易漏診。免疫學(xué)診斷方法目前主要的難題是如何區(qū)分新發(fā)感染和既往感染。PCR 技術(shù)以及在此基礎(chǔ)上衍生出的各種新檢測(cè)技術(shù),大大提高了對(duì)弓形蟲(chóng)病檢測(cè)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性,但仍存在基層推廣有一定局限性[2]。因此，急需一種既準(zhǔn)確又簡(jiǎn)單的診斷弓形蟲(chóng)病的方法。

研究表明，弓形蟲(chóng)的多種蛋白均可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。致密顆粒蛋白10(dense granule protein10,GRA10)是弓形蟲(chóng)致密顆粒分泌的一種蛋白，它表達(dá)量高，而且其在弓形蟲(chóng)緩殖子和速殖子時(shí)期均可表達(dá)。經(jīng)預(yù)測(cè)，GRA10具有較好的免疫原性，所以認(rèn)為GRA10是潛在的特異好的弓形蟲(chóng)病診斷標(biāo)識(shí)。

本研究擬構(gòu)建GRA10(AA 4-487)原核表達(dá)載體pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定，為將重組GRA10(AA 4-487)蛋白用于弓形蟲(chóng)病診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DH5α克隆菌株、BL21(DE3)表達(dá)菌株、ME49型弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和小提質(zhì)粒試劑盒均購(gòu)自北京全式金公司；同源重組試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；His-Tag小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；Alexa488標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Licor公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)ToxoDB中弓形蟲(chóng)ME49蟲(chóng)株的GRA10(AA 4-487)基因設(shè)計(jì)引物，上游引物:5’-ACCGCGAACAGATTGGAGGTCTGTACTACCGGCTGAGCA-3’；下游引物:5’-TCGAATTCGGATCCTCTAGTTCACTTTCGCGAGGGTAGCATGG-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 GRA10(AA 4-487)基因的PCR擴(kuò)增

提取弓形蟲(chóng)ME49株RNA然后制備弓形蟲(chóng)cDNA。弓形蟲(chóng)RNA的提取:將收集的蟲(chóng)體離心，棄上清，加入1mL Trizol重懸，并反復(fù)吹打混勻后將樣品轉(zhuǎn)入1.5mL無(wú)RNase的離心管中，劇烈震蕩渦旋3min，使蟲(chóng)體充分裂解，室溫放置10min；按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置2～3min；4℃12000r/min離心15min；小心吸取上層水相置于新的1.5mL無(wú)RNase的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后，置于室溫沉淀10min；4℃12000r/min離心10min，棄去上清，RNA將以白色沉淀的形式沉于管底；加入1mL用DEPC水配成的75%乙醇，翻轉(zhuǎn)離心管，洗滌沉淀；4℃7500r/min離心5min，盡量棄去上清，在超凈臺(tái)中風(fēng)干；加入30μL無(wú) RNase DEPC水，溶解RNA沉淀；用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的總RNA質(zhì)量并通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度。弓形蟲(chóng)cDNA的制備:將0.1～0.5ng總RNA和1μL Oligo(dT)18混合，再加入無(wú)核酸酶的高純水補(bǔ)至12μL混合；在PCR儀中65℃反應(yīng)5min，冰上冷卻。取上述產(chǎn)物12μL，5×Reaction Buffer 4μL，RiboLockTMRNA 酶抑制劑1μL，10mmol/L dNTP Mix 2μL和RevertAidTMM-Mu LV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL混合，總體積20μL；在PCR儀中42℃ 60min，70℃ 5min，產(chǎn)物-20℃儲(chǔ)存。以最后產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，模板1μL，5×KD plus buffer 10μL，上下游引物各1μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，KD plus DNA聚合酶 1μL，滅菌水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s；58℃退火30s；68℃延伸1min40s；共35個(gè)循環(huán)；68℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 GRA10(AA 4-487)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的回收

按照DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.4 同源重組構(gòu)建質(zhì)粒

按照諾唯贊多片段克隆試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.5 重組GRA10(AA 4-487)的表達(dá)鑒定

將含有pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)質(zhì)粒的BL21(DE3)表達(dá)菌接種到LB中，于37℃以180r/min震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液光密度D600nm值到達(dá)0.5左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，于37℃以180r/min震蕩誘導(dǎo)3h。收集菌液于4℃6000r/min離心12min，棄去上清，用20mL的His-binding buffer重懸，再用高壓細(xì)胞破碎儀破碎。待菌液呈澄清半透明時(shí)取200μL在4℃以12000g離心10min，取上清40μL加入50μL 2×SDS上樣緩沖液和10μL DTT充分混合；將上清去除后用200μL ddH2O重懸包涵體，取40μL 加入50μL 2×SDS上樣緩沖液和10μL DTT充分混合；將上述2種樣品沸水煮10min，冰上冷卻5min然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)分析。

1.2.6 重組GRA10(AA 4-487)蛋白的純化

將表達(dá)后的菌液4℃ 6000r/min離心12min，棄上清；以1/10原培養(yǎng)基體積的緩沖液A重懸沉淀，再用高壓細(xì)胞破碎儀破碎3次；4℃12000r/min離心10min，棄上清；用PBS洗滌沉淀2～3次；往沉淀中加19.7mL緩沖液A、9.7μL 5mmol/L DTT和0.3mL 20%N-十二烷基肌氨酸鈉，劇烈攪拌使其溶解，室溫靜置30min2h；4℃12000r/min離心20min，取上清；加入終濃度為0.2%的PEG4000,1.0mmol/L氧化性谷胱甘肽和0.2mmol/L還原性谷胱甘肽，室溫靜置30min～2h；將上述樣品加入透析袋后用PBS透析3d，然后用蔗糖濃縮后-80℃保存。

1.2.7 重組GRA10(AA 4-487)蛋白的Western blot鑒定

將需要進(jìn)行Western blot鑒定的凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡；取8張濾紙和一張硝酸纖維素膜(NC膜)，將8張濾紙浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液，將NC膜浸泡在甲醛溶液中30s后迅速用ddH2O洗5s再浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液；用濕電轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到NC膜上。將NC膜放入小托盤(pán)中，加入封閉液(1%BSA或5%脫脂奶粉，溶于PBS)，平放在平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上于室溫震搖2h；用PBS洗滌5次，每次5min。NC膜浸泡于1︰2000稀釋His-Tag的小鼠單克隆抗體的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h；用TBST洗滌5次；浸泡于1︰10000稀釋熒光羊抗鼠抗體的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h，注意避光；用TBST洗滌5次后用儀器拍照。

NC膜浸泡于1︰500稀釋感染弓形蟲(chóng)小鼠的陽(yáng)性血清的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h；用TBST洗滌5次；浸泡于1︰2000稀釋HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)的TBST溶液中，于室溫平緩震搖2h；用TBST洗滌5次后加顯色液用儀器拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因GRA10(AA 4-487)的擴(kuò)增

1.GRA10(AA 4-487);M.Marker圖1 GRA10(AA 4-487)片段的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

以弓形蟲(chóng)cDNA為模板擴(kuò)增GRA10(AA 4-487)基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1452bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 重組質(zhì)粒pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)與原載體pE-SUMO的對(duì)比鑒定

挑取陽(yáng)性克隆，在含氨芐青霉素的LB過(guò)夜震搖培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，然后和原始質(zhì)粒pE-SUMO經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比，可見(jiàn)含有插入片段的陽(yáng)性克隆較空載體大小增加(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)測(cè)序鑒定

M.Marker；1.pE-SUMO;2.pE-SUMO-GRA(AA 4-487)圖2 pE-SUMO與pE-SUMO-GRA(AA 4-487) 的瓊脂糖凝膠電泳圖

將潛在的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果良好，彩圖顯示峰尖單一，送測(cè)的重組質(zhì)粒基因序列與原始基因序列一致，pE-SUMO與GRA10(AA 4-487)接頭部分正常(圖3)。

2.4 融合蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒的表達(dá)菌轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)后加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后使用高壓細(xì)胞破碎儀破碎，分別取上清和沉淀同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖4與圖5。誘導(dǎo)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，分子質(zhì)量約為64ku，與計(jì)算的理論分子量相符。

圖3 pE?SUMO與GRA10(AA4?487)接頭部分測(cè)序圖譜M Marker；1 包涵體；2 上清圖4 pE?SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的SDS?PAGE分析

2.5 融合蛋白pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)的Western blot 鑒定

Western blot分析顯示，融合蛋白pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)能被His-Tag的小鼠單克隆抗體抗體識(shí)別(圖6)，說(shuō)明目的蛋白能夠正常表達(dá)并被識(shí)別。

Western blot分析顯示，融合蛋白pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)能被感染弓形蟲(chóng)小鼠陽(yáng)性血清識(shí)別(圖7)，說(shuō)明目的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能被陽(yáng)性血清中的抗體識(shí)別，能用于弓形蟲(chóng)病診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

M Marker；1 包涵體；2 上清圖5 pE?SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白上清與包涵體的SDS?PAGE分析M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)3h菌液；2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)菌液；3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)3h菌液高壓破碎上清；4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)3h菌液高壓破碎沉淀圖6 SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白HIS標(biāo)簽的鑒定M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 pE?SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白；2 陰性對(duì)照?qǐng)D7 SUMO?GRA10(AA4?487)融合蛋白被感染弓形蟲(chóng)小鼠血清的識(shí)別情況

3 討論

越來(lái)越多的研究證明弓形蟲(chóng)分泌細(xì)胞器分泌的致密顆粒蛋白和棒狀體與調(diào)制宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路有關(guān)，導(dǎo)致寄生蟲(chóng)可以逃避宿主免疫[3～5]。弓形蟲(chóng)致密顆粒分泌的致密顆粒蛋白是一類(lèi)重要的分泌代謝性抗原，在弓形蟲(chóng)病原體與宿主細(xì)胞的相互作用中起重要作用。研究證明，弓形蟲(chóng)致密顆粒分泌的致密顆粒蛋白即可用于弓形蟲(chóng)病的診斷，又對(duì)弓形蟲(chóng)的感染有一定的保護(hù)作用。

致密顆粒是一種弓形蟲(chóng)頂端復(fù)合體的細(xì)胞器，可分泌致密顆粒蛋白(dense granule proteins，GRA)，其中GRA1(P24)、GRA2(P28)、GRA4(P40)、GRA6 和GRA7(P29)是5 種主要的GRA 蛋白。GRA1(P24)是慢性弓形蟲(chóng)病的標(biāo)志性抗原分子，通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子的濃度穩(wěn)定納蟲(chóng)空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)；GRA2(P28)是一個(gè)毒力相關(guān)抗原，在弓形蟲(chóng)入侵宿主后誘導(dǎo)納蟲(chóng)空泡(parasitophorous vacuole，PV)表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成；GRA4(P40)、GRA6和GRA7(P29)在修飾調(diào)理PV的過(guò)程中起重要作用，參與PV網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，參與蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制，研究發(fā)現(xiàn)這些分子的DNA 疫苗或重組抗原可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)力，提示GRA1、GRA2、GRA4、GRA6和GRA7抗原是5個(gè)有希望的疫苗分子[6～10]。但它們產(chǎn)生的保護(hù)力通常較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到人們所期望的水平，因此人們將對(duì)弓形蟲(chóng)的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及表觀(guān)遺傳學(xué)進(jìn)行深入研究，從而弄清弓形蟲(chóng)抗原的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，選擇更有效的候選基因或編碼該基因的相關(guān)表位以及合適的表達(dá)載體，構(gòu)建多價(jià)高效的復(fù)合基因疫苗或含有基因佐劑的混合基因疫苗或多表位疫苗；研究這些疫苗的轉(zhuǎn)化效率、免疫原性、MHC 限制性以及能否長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)表達(dá)[11]。

GRA10是在弓形蟲(chóng)高表達(dá)的保守基因。弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白在速殖子和緩殖子中大量分泌[12]，在早期感染弓形蟲(chóng)宿主的血液中可以被發(fā)現(xiàn)[13]，從而使致密顆粒蛋白成為有吸引力的候選疫苗。分析了弓形蟲(chóng)GRA10蛋白的細(xì)胞定位后發(fā)現(xiàn)它密集地集中在致密顆粒中，稀疏分布于弓形蟲(chóng)速殖子的胞漿和納蟲(chóng)空泡內(nèi)，但沒(méi)有出現(xiàn)在納蟲(chóng)空泡膜上[14]。這與膜的關(guān)聯(lián)分析是一致的，顯示了GRA10蛋白在弓形蟲(chóng)細(xì)胞溶解產(chǎn)物中而不是在膜上。納蟲(chóng)空泡對(duì)弓形蟲(chóng)從宿主細(xì)胞中獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很重要[15]，對(duì)消除弓形蟲(chóng)代謝廢物也很重要[16,17]。

綜上所述，因?yàn)楣蜗x(chóng)的宿主范圍廣泛，抗原成分復(fù)雜，導(dǎo)致研究進(jìn)展緩慢。而致密顆粒蛋白是弓形蟲(chóng)的一種十分重要的蛋白，近年來(lái)的研究表明該蛋白對(duì)于弓形蟲(chóng)病的防治有著重要的意義。本研究利用弓形蟲(chóng)ME49蟲(chóng)株cDNA為模板擴(kuò)增GRA10(AA 4-487)的編碼片段，建立了重組質(zhì)粒pE-SUMO-GRA10(AA 4-487)，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物能夠被His-Tag的小鼠單克隆抗體抗體和感染弓形蟲(chóng)小鼠陽(yáng)性血清識(shí)別，說(shuō)明其具有免疫反應(yīng)性，從而為弓形蟲(chóng)病診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

如何有效防治弓形蟲(chóng)病已是現(xiàn)在人們必須面對(duì)的難題，但是弓形蟲(chóng)生活史非常復(fù)雜，所導(dǎo)致的機(jī)體免疫也多種多樣，弓形蟲(chóng)病可由卵囊和包囊感染，而且其蛋白質(zhì)有上千種，因此找尋到具有免疫反應(yīng)性的蛋白十分重要，可以讓人們進(jìn)一步了解弓形蟲(chóng)病引起的機(jī)體免疫。本研究所構(gòu)建的重組GRA10(AA 4-487)蛋白可為未來(lái)防治弓形蟲(chóng)病提供一定幫助，但還需要對(duì)弓形蟲(chóng)不同階段、不同抗原進(jìn)行更加透徹的了解，才能取得更好的療效。

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[編輯] 余文斌