反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH?法、ABTS＋?法評(píng)價(jià)抗氧化性結(jié)果的影響

林戀竹，趙謀明

目的：大多數(shù)抗氧化活性評(píng)價(jià)方法主要基于兩種機(jī)制：氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移（HAT）和電子轉(zhuǎn)移（ET）。由于DPPH?法、ABTS＋?法操作簡單，常被用作為抗氧化活性評(píng)價(jià)方法。用這兩種方法進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)時(shí)，通常用固定反應(yīng)時(shí)間下算得的 IC50值（自由基清除率為50%時(shí)所需試樣濃度）表征抗氧化劑的抗氧化活性強(qiáng)弱。DPPH?法、ABTS＋?法并非純粹基于ET機(jī)制，在反應(yīng)過程中，也會(huì)伴隨HAT機(jī)制。因此，在不了解抗氧化劑與DPPH自由基、ABTS＋反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制的情況下，就簡單將反應(yīng)控制在某一時(shí)間下，并在相同條件下，與其它抗氧化劑的IC50值比較，可能對(duì)抗氧化劑的抗氧化活性帶來錯(cuò)誤的判斷。本文研究了食品工業(yè)中常用的12種抗氧化劑與DPPH自由基、ABTS＋的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，為DPPH?法、ABTS＋?法評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性提供可參考的信息。方法：以食品工業(yè)常用的6種合成抗氧化劑（BHA，BHT，TBHQ，抗壞血酸棕櫚酸酯，D-異抗壞血酸鈉，和抗壞血酸）以及6種天然抗氧化劑（VE油，茶多酚，竹葉提取物，迷迭香提取物，單寧酸，和蘆?。檠芯繉?duì)象，采用紫外-可見分光光度法，分別研究這12種抗氧化劑與DPPH自由基、ABTS＋的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。根據(jù) 12種抗氧化劑對(duì) DPPH自由基的清除率計(jì)算得到的 IC50值，將抗氧化劑分為兩組：（1）單寧酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗壞血酸、蘆丁、BHT、D-異抗壞血酸鈉；（2）抗壞血酸棕櫚酸酯、迷迭香提取物、竹葉提取物、VE油。前一組抗氧化劑配制成10 μg/mL；后一組抗氧化劑配制成30 μg/mL。分別測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下，測(cè)定反應(yīng)體系在517 nm處的吸光度值，計(jì)算抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除率，繪制抗氧化劑與DPPH自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線；根據(jù)12種抗氧化劑對(duì)ABTS＋的清除率計(jì)算得到的 IC50值，將抗氧化劑分為兩組：一組為：單寧酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗壞血酸、蘆丁、BHT、D-異抗壞血酸鈉；另一組為抗壞血酸棕櫚酸酯，迷迭香提取物，竹葉提取物，VE油。前一組試樣配制成100 μg/mL；后一組試樣配制成600 μg/mL。分別測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下，測(cè)定反應(yīng)體系在734 nm處的吸光度值，計(jì)算抗氧化劑對(duì)ABTS＋的清除率，繪制抗氧化劑與ABTS＋的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。結(jié)果：TBHQ、抗壞血酸、D-異抗壞血酸鈉、抗壞血酸棕櫚酸酯、VE油與DPPH自由基反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)速率很快，反應(yīng)很快達(dá)到平衡。而單寧酸、茶多酚、BHA、蘆丁、BHT、迷迭香提取物與竹葉提取物的與DPPH自由基反應(yīng)時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率隨著反應(yīng)時(shí)間延長顯著增加。在反應(yīng)初期（6 min時(shí)），各試樣DPPH自由基清除能力按如下強(qiáng)弱順序排列：單寧酸＞茶多酚＞TBHQ＞BHA＞抗壞血酸＞蘆?。綝-異抗壞血酸鈉＞BHT；而在反應(yīng)時(shí)間為18 min時(shí)，各試樣DPPH?清除能力的強(qiáng)弱順序發(fā)生改變：單寧酸＞茶多酚＞TBHQ＝BHA＞蘆?。究箟难幔綛HT＞D-異抗壞血酸鈉；在反應(yīng)時(shí)間為42 min時(shí)，BHT的DPPH自由基清除能力超過抗壞血酸的DPPH自由基清除能力。BHA、抗壞血酸、TBHQ、D-異抗壞血酸鈉、VE油的 ABTS＋清除能力隨時(shí)間延長無顯著性變化，其與ABTS＋的反應(yīng)速率很快，反應(yīng)很快達(dá)到平衡。而單寧酸、茶多酚、蘆丁、BHT、竹葉提取物、迷迭香提取物、抗壞血酸棕櫚酸酯的 ABTS＋清除能力隨時(shí)間延長顯著增加。在反應(yīng)初期（6 min時(shí)），各試樣 ABTS＋清除能力按如下強(qiáng)弱順序排列：單寧酸＞茶多酚＞蘆?。綛HA＞抗壞血酸＝TBHQ＝BHT＞D-異抗壞血酸鈉；而在反應(yīng)時(shí)間為12 min時(shí)，BHT的ABTS＋清除能力超過了BHA、抗壞血酸、TBHQ。另外，在反應(yīng)初期（6 min時(shí)），各試樣ABTS＋清除能力按如下強(qiáng)弱順序排列：抗壞血酸棕櫚酸酯＞竹葉提取物＞迷迭香提取物＞VE油；而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為24 min時(shí)，竹葉提取物的 ABTS＋清除能力超過抗壞血酸棕櫚酸酯。結(jié)論：不同抗氧化劑因其結(jié)構(gòu)的差異，與DPPH自由基、ABTS＋反應(yīng)速率不同，反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間不同，若反應(yīng)時(shí)間短暫，可能對(duì)抗氧化劑的抗氧化性評(píng)價(jià)帶來錯(cuò)誤的判斷。采用DPPH法、ABTS＋法評(píng)定試樣抗氧化活性時(shí)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長到60 min時(shí)，試樣的DPPH自由基、ABTS＋清除能力排序已經(jīng)趨于穩(wěn)定。因此，可選用反應(yīng)時(shí)間60 min作為DPPH法、ABTS＋法評(píng)價(jià)試樣抗氧化活性強(qiáng)弱的最佳反應(yīng)時(shí)間。

來源出版物：食品科學(xué), 2010, 31(5): 63-67

入選年份：2015