間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體與肺動(dòng)脈高壓

黃菲菲，王良興，黃曉穎

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，溫州市呼吸循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015）

外泌體（exosomes，EXOs）是由HARDING等[1]在1983年首次發(fā)現(xiàn)。最初認(rèn)為EXOs是由成熟紅細(xì)胞分泌，用于排出轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)大部分細(xì)胞皆可分泌EXOs，且其功能主要取決于來(lái)源細(xì)胞[2]。肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）發(fā)病機(jī)制尚未明確，尚無(wú)特效藥。有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）能夠產(chǎn)生EXOs，并有報(bào)道其可抑制平滑肌細(xì)胞增殖、降低PAH[3]。筆者就MSCs來(lái)源EXOs與PAH的研究進(jìn)展做一綜述。

1 EXOs

1.1 EXOs概述 EXOs是一種納米級(jí)結(jié)構(gòu)，它由脂質(zhì)雙分子層包裹，直徑介于30～100 nm之間，能夠通過(guò)各種各樣的方式廣泛分布于唾液、血漿、尿液等體液中[4]。EXOs內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)，其中四跨膜蛋白家族含量最豐富，包括CD63、CD81、CD82、CD9等，存在于大多數(shù)不同來(lái)源的EXOs中。EXOs內(nèi)還含有actins、annexins、TSG101（tumor susceptibility gene 101 protein）、fibronectin-1、VAMP8（vesicle-associated membrane protein 8）等與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、組裝、形態(tài)等有關(guān)的蛋白質(zhì)[5]。此外，EXOs中還有miRNA、mRNA、tRNA、rRNA等不同種類的RNA。miRNA是一類包含20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA家族，它們不編碼蛋白質(zhì)，但能夠通過(guò)與特定的mRNA結(jié)合并使之降解來(lái)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯水平，從而調(diào)控目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后水平上的表達(dá)。miRNA可以通過(guò)EXOs在細(xì)胞之間水平傳遞[6]，使細(xì)胞內(nèi)不同miRNA的含量根據(jù)環(huán)境的變化而發(fā)生改變。EXOs中也含有豐富的脂質(zhì)成分，主要包括膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺以及卵磷脂等[7]，這些脂質(zhì)不僅組成了EXOs的膜，在內(nèi)容物的分選上也發(fā)揮了重要作用。

圖1 EXOs形成和分泌

1.2 EXOs形成機(jī)制和功能 EXOs首先由細(xì)胞膜內(nèi)出芽形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體膜內(nèi)出芽，包裹內(nèi)容物形成腔內(nèi)體，隨即成熟為多囊泡體（晚期內(nèi)體），多囊泡體最后與細(xì)胞膜融合，釋放腔內(nèi)體至細(xì)胞外形成EXOs（見(jiàn)圖1）。蛋白質(zhì)、miRNA、脂質(zhì)等不同的內(nèi)容物被分選進(jìn)入多囊泡體，需要依賴于不同的機(jī)制，包括ESCRT（endosomal sorting complexes required for transport）依賴性和ESCRT非依賴性機(jī)制。成熟的多囊泡體膜與細(xì)胞膜融合并釋放EXOs，被釋放到細(xì)胞外的EXOs會(huì)以旁分泌或自分泌的方式，在人體內(nèi)各種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮作用，它們可以通過(guò)受體配體相結(jié)合、與受體細(xì)胞胞膜直接結(jié)合或與受體細(xì)胞胞膜相互融合的方式，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞與物質(zhì)交換。自從發(fā)現(xiàn)EXOs以來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注EXOs對(duì)疾病的治療作用。大量研究表明，來(lái)源于不同細(xì)胞、不同環(huán)境的EXOs在功能上具有顯著的差別。曹蕾等[8]將小鼠黑素細(xì)胞瘤來(lái)源的EXOs與MSCs共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，MSCs獲得了黑素細(xì)胞瘤的增殖和遷移能力，這表明黑素細(xì)胞來(lái)源的EXOs具有黑素細(xì)胞瘤的特性。然而，ONO等[9]將乳腺癌細(xì)胞系與人骨髓MSCs來(lái)源的EXOs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)EXOs可以有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其休眠。此外，有研究利用人臍帶MSCs來(lái)源EXOs在體外治療人肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EXOs能抑制丙肝病毒復(fù)制，并且其與抗病毒藥物具有協(xié)同治療作用[10]。因此，選擇合適來(lái)源的EXOs是利用EXOs治療相關(guān)疾病的重要一環(huán)。EXOs在宏觀組成上都含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等物質(zhì)，但是在微觀構(gòu)成中存在明顯的差異，不同細(xì)胞分泌的EXOs，由于其所處的微環(huán)境不同，導(dǎo)致內(nèi)含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA等在種類及比例上都各不相同，這可能是造成EXOs功能各異的主要原因。

2 MSCs

2.1 MSCs概述 MSCs是一種多潛能的非造血前體細(xì)胞，來(lái)源于很多成熟組織，尤其是骨髓、脂肪組織和臍帶，不同組織來(lái)源的MSCs有許多相似之處[11]。MSCs不僅可以分化為軟骨、肝組織、肌肉、韌帶、肌腱等，還能向受損組織趨化[12]，通過(guò)旁分泌方式釋放細(xì)胞因子，發(fā)揮對(duì)組織器官的修復(fù)和保護(hù)作用，是一種有前景的能夠用于疾病治療的干細(xì)胞來(lái)源。

2.2 MSCs旁分泌作用 1996年HAYNESWORTH等[13]發(fā)現(xiàn)MSCs能夠合成和分泌不同種類的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)附近細(xì)胞的功能，這是MSCs的旁分泌作用的首次報(bào)道。MSCs通過(guò)旁分泌作用釋放上述物質(zhì)，促進(jìn)血管再生、抗炎、抗氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。BABER等[14]給大鼠氣管內(nèi)注射轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因lacZ的MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs可降低肺血管阻力，減輕心室肥厚，有效緩解野百合堿誘導(dǎo)的PAH。他們還通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明lacZ標(biāo)記的MSCs只存在于肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，并不存在于肺血管中，說(shuō)明MSCs不是直接作用于肺血管，而可能是通過(guò)間接途徑影響肺血管。LIANG等[15]發(fā)現(xiàn)用培養(yǎng)MSCs的培養(yǎng)基處理肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。此外，GNECCHI等[16]也發(fā)現(xiàn)給予MSCs培養(yǎng)基可使梗死心肌獲得改善心功能和抑制心室重塑的效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)MSCs條件培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子-2（epidermal growth factor-2，EGF-2）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）和胸腺素β-4（thymosin，TB4）等心功能調(diào)節(jié)因子的表達(dá)均上調(diào)，由此可見(jiàn)，MSCs對(duì)心功能的恢復(fù)作用可能是通過(guò)分泌相應(yīng)的調(diào)節(jié)因子起作用的。最近研究表明，MSCs通過(guò)旁分泌VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細(xì)胞因子促進(jìn)受損兔角膜的愈合[17]。盡管MSCs能夠根據(jù)特定的環(huán)境分化成內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和胰腺細(xì)胞等，但是向病變部位趨化的MSCs由于受到移植環(huán)境中不良因素的影響生存率較低，只有很少部分的移植MSCs會(huì)出現(xiàn)在靶組織中[12]，不足以分化出充足的細(xì)胞來(lái)代替修復(fù)受損組織，在MSCs保護(hù)和修復(fù)組織器官中旁分泌起到了更大的作用，而在MSCs以旁分泌方式發(fā)揮作用的過(guò)程中，EXOs可能起到了關(guān)鍵作用[18]。

3 MSCs來(lái)源EXOs在PAH中的作用

3.1 PAH概述 PAH是一種進(jìn)展性疾病，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓升高、右心室功能失調(diào)，最終因?yàn)橛倚乃ソ邔?dǎo)致死亡。PAH的血流動(dòng)力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為靜息狀態(tài)下，右心導(dǎo)管法檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥25 mmHg。雖然目前PAH的治療藥物有前列環(huán)素、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶5抑制劑等，PAH患者1年病死率仍高達(dá)15%[19]，而且這些藥物無(wú)法逆轉(zhuǎn)PAH病程，因此探明PAH的發(fā)病機(jī)制，尋找能夠真正逆轉(zhuǎn)PAH的方法成為十分重要的研究課題。

3.2 MSCs來(lái)源EXOs與PAH 研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以顯著降低PAH動(dòng)物右心室壓，抑制右心肥厚、肺血管重塑，減緩PAH的發(fā)展[20]。此外，研究證明MSCs條件培養(yǎng)基能抑制血管平滑肌增生，抑制PAH[21-22]。因此，MSCs發(fā)揮對(duì)PAH的治療和保護(hù)作用，EXOs可能是重要環(huán)節(jié)。LEE等[3]發(fā)現(xiàn)MSCs來(lái)源的EXOs獲得了MSCs的功能。低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH）小鼠靜脈注射MSCs來(lái)源的EXOs，抑制了低氧引起的STAT3和miR17超家族水平的升高，同時(shí)增加了miR204的含量，從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和降低肺動(dòng)脈壓。STAT3能夠直接調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的微小RNA miR-17-92基因簇的轉(zhuǎn)錄，致使骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2型（bone morphogenetic proteins receptor 2，BMPR2）降低[23]。BMPR2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）家族受體，與配體結(jié)合后能夠抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，它的減少會(huì)導(dǎo)致PAH的發(fā)生[24]。CHEN等[25]研究表明，MSCs來(lái)源的直徑在40～300 nm的胞外囊泡有助于降低大鼠mPAP和右心室平均壓力，減輕右心室肥厚，抑制肺細(xì)小動(dòng)脈重塑。ALIOTTA等[26]證明MSCs來(lái)源的胞外囊泡能夠減輕并逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的小鼠PAH，由于胞外囊泡中含有EXOs和微囊泡等不同的成分，所以他們將MSCs來(lái)源的胞外囊泡、EXOs和微囊泡分別注射入PAH小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)只有MSCs來(lái)源的胞外囊泡和EXOs能夠產(chǎn)生上述作用，進(jìn)一步證實(shí)MSCs來(lái)源的胞外囊泡中，真正起到抑制PAH作用的成分是EXOs。上述研究充分說(shuō)明，MSCs來(lái)源EXOs對(duì)PAH有積極的治療作用（見(jiàn)圖2）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，部分miRNA在PAH組織中表達(dá)異常[27]。MSCs來(lái)源EXOs有可能是通過(guò)與肺組織之間發(fā)生miRNA的水平傳遞，影響肺組織中的miRNA種類及含量，發(fā)揮保護(hù)PAH的作用，但具體機(jī)制還有待更進(jìn)一步的研究。

圖2 EXOs對(duì)PAH的作用

4 EXOs的應(yīng)用前景

PAH與腫瘤在分子機(jī)制方面有許多相似的改變[28]，如具有相似的BMPR2基因的改變；此外，原癌蛋白survivin和pim1、低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1）的表達(dá)也都被上調(diào)，這有可能是引起PAH動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖的共同原因。有臨床研究表明，用自體EXOs治療III/IV期黑色素瘤患者，能有效延緩腫瘤生長(zhǎng)速度，并且其不良反應(yīng)很小[29]?；诖?，合適來(lái)源的EXOs對(duì)人類PAH可能也具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖，緩解PAH的作用。

EXOs不僅攜帶有其來(lái)源細(xì)胞的某些功能和特性，同時(shí)還能被改造、加工和修飾。有研究表明，將化療藥物紫杉醇、阿霉素加入到人腦內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的EXOs培養(yǎng)基中，待EXOs攝取化療藥物后通過(guò)微注射方式將其注射入斑馬魚主靜脈中，發(fā)現(xiàn)化療藥物能有效通過(guò)血腦屏障發(fā)揮其治療作用[30]。因此，基于MSCs來(lái)源的EXOs對(duì)PAH的治療作用，以及EXOs能被加工的特性，可以考慮對(duì)EXOs進(jìn)行改造、加工和修飾。目前EXOs臨床應(yīng)用尚少，且主要集中于腫瘤領(lǐng)域，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[3]，MSCs來(lái)源EXOs確實(shí)能夠抑制PAH，具有進(jìn)一步研究的前景。

相對(duì)于傳統(tǒng)的MSCs的移植治療方法，利用MSCs來(lái)源的EXOs有效避免了MSCs移植存活率低的問(wèn)題，且可以降低手術(shù)損傷、防止MSCs分化成其他細(xì)胞、降低MSCs促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[31]以及動(dòng)靜脈注射細(xì)胞引起血管阻塞的可能性[32]。將EXOs通過(guò)靜脈注射到動(dòng)物體內(nèi)，不會(huì)對(duì)肝腎功能、血流動(dòng)力學(xué)、血管、肌肉等造成損害，也不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，這使得利用EXOs來(lái)治療PAH具有許多MSCs移植所不具備的優(yōu)點(diǎn)。

5 小結(jié)與展望

目前對(duì)EXOs的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，在PAH方面的研究仍處于初始階段，我們還需要大量的科學(xué)研究來(lái)探索MSCs-EXOs對(duì)PAH的作用機(jī)制及治療效果，從而為進(jìn)一步的臨床研究打下基礎(chǔ)。