CSFV的反向遺傳系統(tǒng)

趙妍

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072）

1 引言

反向遺傳學(xué)是利用病毒的全長基因組來產(chǎn)生完整病毒的方法，是現(xiàn)在病毒學(xué)研究中最強(qiáng)有力的工具。反向遺傳學(xué)通常用于研究病毒復(fù)制、感染、蛋白功能、病毒與宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年來，反向遺傳學(xué)在CSFV的研究方面得到不斷發(fā)展，本文就CSFV的幾種反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以期為CSFV的研究及防控提供參考。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年因豬瘟造成的經(jīng)濟(jì)損失已超過100億元。豬瘟嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并對食品安全造成威脅。因此，對該病進(jìn)行全面、綜合防控，具有必要的現(xiàn)實(shí)意義。本文對CSFV及功能相關(guān)基因、蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，為全面了解CSFV、全方位防控豬瘟提供理論支持。

2 CSFV的幾種反向遺傳系統(tǒng)

2.1 T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

T7 RNA聚合酶，是一種高度特異識別T7啟動(dòng)子序列的DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動(dòng)子下游NTP的摻入，合成與T7啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA[2]。

Meyers（Meyers et al.,1996）首先對 CSFV 5’到 3’進(jìn)行了全基因組鑒定，將CSFV全基因組克隆到低拷貝質(zhì)粒中，并在基因組3’端加入T7啟動(dòng)子，利用Srf I將質(zhì)粒線性化后，在T7 RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄得到RNA，并轉(zhuǎn)染進(jìn)SK6細(xì)胞系中拯救病毒，這一方法在現(xiàn)在的CSFV研究中依然應(yīng)用十分廣泛。Fan（Fan et al.,2009）將上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，將由T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的vRNA轉(zhuǎn)染到BHK21細(xì)胞系中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將含有病毒的上清感染PK15細(xì)胞，用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。

2.2 T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

Gennip（Gennip et al.,1999）建立了一種更方便、高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反向遺傳系統(tǒng)。首先他建立了可以穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的SK6細(xì)胞系SK6-T7 RNA pol，將線性化的CSFV cDNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，轉(zhuǎn)錄過程在細(xì)胞中完成并得到病毒RNA，產(chǎn)生CSFV病毒，該方法大大提高了病毒滴度，其滴度約為體外轉(zhuǎn)錄的 200 倍[3]。Bergeron（Bergeron,2002）通過在 CSFV 3’端插入了HDV核酶及T7終止子，構(gòu)建了一種新型的基于T7 RNA聚合酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，該系統(tǒng)不需要Srf I就能在CSFV末端形成精確的3’NCR，節(jié)約了構(gòu)建成本。

2.3 II型RNA聚合酶介導(dǎo)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

Li（Li et al.,2013）在CSFV 5’NCR加入 CMV啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子和HamRZ，在3’NCR加入HdvRZ，T7終止子和SV40 polyA，HamRZ與HdvRZ可以生成正確的5’NCR及 3’NCR，且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，該方法拯救的病毒滴度是體外轉(zhuǎn)錄的120倍。

2.4 I型RNA聚合酶介導(dǎo)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

本實(shí)驗(yàn)室在上述基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種新的依賴polⅠ拯救病毒的CSFV cDNA克隆，我們在PK15細(xì)胞基因組中擴(kuò)增得到豬的啟動(dòng)子，并參照文獻(xiàn)合成在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有極高終止效率的鼠終止子，分別插入CSFV 5’NCR之前和3’NCR之后。該系統(tǒng)能直接將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，拯救出CSFV病毒，這種基于polⅠ啟動(dòng)子的反向遺傳操作系統(tǒng)能產(chǎn)生具有精確末端基因組的CSFV，且具有更高的拯救效率，為后續(xù)修飾性減毒活疫苗和標(biāo)記疫苗的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 帶有標(biāo)記的CSFV反向遺傳系統(tǒng)

基于傳統(tǒng)的反向遺傳系統(tǒng)，具有標(biāo)記或定量功能的CSFV cDNA克隆被設(shè)計(jì)出來，如在Li實(shí)驗(yàn)組建立了一種簡化的中和抗體試驗(yàn)，用于檢測CSFV，首先在Npro后插入了EGFP基因，在病毒產(chǎn)生的同時(shí)合成EGFP，從而省去熒光染色，達(dá)到檢測病毒的目的[4]。本實(shí)驗(yàn)室在1.4中的反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，在Npro后面加入了Rluc基因，得到了可以用于定量實(shí)驗(yàn)的CSFV反向遺傳系統(tǒng)，即可以通過收集Rluc氧化過程中釋放的生物熒光，定量地檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因的相互作用。

帶有標(biāo)記的CSFV反向遺傳系統(tǒng)在傳統(tǒng)的反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，在達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡耐瑫r(shí)，使反應(yīng)更加快速，簡便，增加了方法的實(shí)用性，為后續(xù)開展修飾性減毒活疫苗和標(biāo)記疫苗的研發(fā)做了很好的鋪墊。

4 展望

反向遺傳操作系統(tǒng)為RNA病毒研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的平臺，能夠恢復(fù)具有全長病毒基因組的病毒[5]。利用這個(gè)平臺，人們可以通過基因重組、基因突變等 手段來研究病毒的復(fù)制、感染，病毒蛋白的功能、病毒與宿主細(xì)胞之間的關(guān)系?？共《静呗院蜆?biāo)記疫苗的發(fā)展也離不開反向遺傳操作，如找出與毒力相關(guān)性基因，對其進(jìn)行缺失或修飾處理，從而得到新的無毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗，同時(shí)可以制備嵌合抗體，開發(fā)多價(jià)疫苗[6]。反向遺傳系統(tǒng)作為動(dòng)物病毒的研究方法，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫苗、CSFV毒力機(jī)制及蛋白功能研究中，極大地推動(dòng)了動(dòng)物病毒的研究發(fā)展，為疾病的研究及防控起著重要作用。