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    不同哺乳動(dòng)物密碼子偏性及聚類分析

    2018-02-06 21:34:48楊佳棟劉月琴張英杰
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年15期
    關(guān)鍵詞:哺乳動(dòng)物聚類分析

    楊佳棟 劉月琴 張英杰

    摘要:為更好地認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物GDF9基因在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為適應(yīng)環(huán)境形成的密碼子使用模式,通過(guò)CodonW軟件計(jì)算不同哺乳動(dòng)物GDF9基因的密碼子偏性指標(biāo),利用SPSS軟件對(duì)密碼子偏好性影響因素的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)合密碼子偏性和最小進(jìn)化法分析其親緣關(guān)系。GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT為哺乳動(dòng)物GDF9基因的最優(yōu)密碼子,該基因偏愛使用以A或T結(jié)尾的密碼子;G、C含量和蛋白質(zhì)親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素;聚類分析提示不同哺乳動(dòng)物間的同源性越高,GDF9基因密碼子使用特征的相似性越高。

    關(guān)鍵詞:哺乳動(dòng)物;GDF9;堿基替換;密碼子偏性;聚類分析

    中圖分類號(hào): Q755文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2017)15-0041-05

    在雌性哺乳動(dòng)物整個(gè)生殖周期過(guò)程中,卵母細(xì)胞只能來(lái)源于原始卵泡庫(kù)[1]。有研究表明,原始卵泡形成過(guò)程受激素、轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)通路的介導(dǎo)[2]。生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員之一,在卵泡的發(fā)育過(guò)程中有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[3]。密碼子是DNA或RNA的堿基序列與其編碼蛋白序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系[4]。編碼相同氨基酸的密碼子為同義密碼子,在蛋白合成過(guò)程中,同義密碼子的使用頻率存在差異,且物種和基因?qū)δ骋环N或幾種密碼子的使用具有偏好性[5]。對(duì)基因密碼子偏好參數(shù)進(jìn)行分析,能更好地理解和研究基因水平轉(zhuǎn)移和基因家族分化的發(fā)生[6]。因此對(duì)密碼子偏好性的研究可在分子的角度為GDF9基因序列特征、分類和遺傳進(jìn)化規(guī)律提供重要信息。前人相關(guān)研究表明,GDF9基因具有刺激顆粒細(xì)胞減數(shù)分裂、抑制素的生成作用[7],并影響卵泡發(fā)育和生殖功能[8]。Wang等發(fā)現(xiàn)通過(guò)siRNA敲除GDF9后能抑制倉(cāng)鼠原始卵泡的形成,但添加GDF9純品培養(yǎng)卵巢會(huì)加速原始卵泡的形成[9]。在人、嚙齒類、牛、綿羊和有袋類動(dòng)物卵巢卵母細(xì)胞中,GDF9基因特異性表達(dá),但該基因在山羊卵母細(xì)胞和黃體中可同時(shí)表達(dá)[10-11]。GDF9基因還能通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程[12]。馬會(huì)明等通過(guò)RNA干擾使該基因表達(dá)沉默,也能抑制顆粒細(xì)胞增殖過(guò)程[13]。這些研究通過(guò)探討不同哺乳動(dòng)物已被克隆的GDF9基因,并在卵巢卵母細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)表達(dá)分析,但未開展密碼子使用偏性的研究,這不利于其異源表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化等后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。GDF9基因密碼子使用偏好性的研究能為該基因的分類和進(jìn)化提供重要信息。本研究利用CodonW軟件分析不同哺乳動(dòng)物GDF9基因?qū)γ艽a子的使用情況,基于GDF9基因最小進(jìn)化法和同義密碼子相對(duì)使用度的歐式平方距離系數(shù)建立聚類關(guān)系,為GDF9基因功能的深入研究提供參考依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1目的基因的來(lái)源

    本研究所用基因資料都來(lái)源于Nucleotide(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)數(shù)據(jù)庫(kù),12種物種包括靈長(zhǎng)目蘇門答臘猩猩、普通狨猴和人,食肉目家貓和家犬,偶蹄目家牛、牦牛、綿羊、山羊和野豬,嚙齒目小家鼠和褐家鼠。各哺乳動(dòng)物GDF9都是完整的cDNA序列(表1)。利用MEGA 6.0對(duì)上述核苷酸序列進(jìn)行堿基分析。

    1.2目的基因的篩選

    對(duì)候選的哺乳動(dòng)物GDF9基因cDNA序列進(jìn)行如下規(guī)則的篩選:(1)cDNA序列為完整編碼蛋白序列;(2)該cDNA序列長(zhǎng)度>300 bp;(3)蛋白翻譯部位位于細(xì)胞質(zhì);(4)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及病毒上的基因不予考慮;(5)多拷貝基因不重復(fù)計(jì)算。

    1.3相關(guān)密碼子偏性分析指標(biāo)

    通過(guò)CodonW軟件來(lái)分析GDF9基因密碼子使用偏性,分析數(shù)值包括有效密碼子數(shù)(effective number of codons,ENc)、密碼子偏愛指數(shù)(condon bias index,CBI)、同義密碼子相對(duì)使用度(relative synonymous codon usage,RSCU);同時(shí)通過(guò)該軟件來(lái)分析GDF9基因密碼子偏性的影響因素,即GC含量(GC)、密碼子第3位的GC含量(GC3s)、芳香族氨基酸比例(aromatic amino acid ratio)、蛋白質(zhì)親水性(protein hydrophilicity)的相關(guān)性。

    1.4堿基替代飽和度檢驗(yàn)

    利用BioEdit軟件對(duì)不同哺乳動(dòng)物GDF9基因的cDNA序列進(jìn)行比對(duì),將比對(duì)結(jié)果保存為fasta格式,通過(guò)DAMBE軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果的堿基替代飽和度進(jìn)行檢驗(yàn),若轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)沒有達(dá)到飽和,可進(jìn)行下一步的系統(tǒng)發(fā)育分析,反之亦然。

    1.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    通過(guò)CodonW軟件計(jì)算出不同哺乳動(dòng)物GDF9基因的RSCU值,利用SPSS多元分析軟件計(jì)算其相應(yīng)的歐氏平方距離,并進(jìn)行系統(tǒng)聚類。通過(guò)MEGA軟件中最小進(jìn)化法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同物種GDF9基因序列堿基特征

    由表1可知,在12種物種中,靈長(zhǎng)目蘇門答臘猩猩和人cDNA序列長(zhǎng)度最短,但與普通狨猴差別較大,相差250 bp。偶蹄目家牛、牦牛和綿羊cDNA序列最長(zhǎng),但野豬cDNA序列短27 bp,這可能與單胃和反芻動(dòng)物分類有關(guān)。在ATCG堿基分布中,除小家鼠(A+T=45.9%)、野豬(A+T=49.8%)和褐家鼠(A+T=47.2%)外,其余物種A+T堿基含量高于 G+C 堿基含量,表明GDF9基因更傾向于使用A或T堿基。

    2.2密碼子使用偏性分析

    ENc能反映密碼子使用頻率和同義密碼子平均使用頻率的偏差。ENc越小,偏好性越強(qiáng),即高表達(dá)基因易于使用一種或幾種同義密碼子,反之亦然,即低表達(dá)基因所包含的稀有密碼子種類越多[14-15]。由表1可知,除家貓之外,其余11種哺乳動(dòng)物的有效密碼子數(shù)均小于55,表明GDF9基因?qū)νx密碼子使用存在一定的偏好性。但各哺乳動(dòng)物的GC3s值與其G+C堿基含量有差異。當(dāng)CBI>0時(shí),即在0~1范圍之間;越接近0,表示該基因?qū)γ艽a子使用為完全隨機(jī),不存在偏性,反之亦然。本研究所用物種的密碼子偏愛指數(shù)均>0,其中家牛和牦牛的CBI值最小,均為0.024,小家鼠的CBI值最大,為0.107,但該值也遠(yuǎn)離1,表明不同哺乳動(dòng)物GDF9基因?qū)γ艽a子的使用不存在絕對(duì)的偏好性。endprint

    RSCU值的大小能反映同義密碼子家族的密碼子使用偏移情況,當(dāng)RSCU=1時(shí),表明密碼子使用沒有偏性;當(dāng) RSCU>1 時(shí),表明此密碼子使用頻率較高[16]。由表2可知,RSCU>1.5的密碼子有25個(gè),其中以GCT、TGT、TTT、GGG、ATT、CTG、CCT、CAG、AGA、AGG、ACT、ACC和CTG密碼子的使用頻率較高,同時(shí)可得出GDF9基因偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。

    2.3密碼子使用偏性的影響因素分析

    由表3可知,GC、GC3s和Aromo都與CBI呈正相關(guān),其中GC與CBI呈顯著正相關(guān),Gravy與CBI呈負(fù)相關(guān);GC、GC3s和Gravy都與ENc呈負(fù)相關(guān),其中Gravy與ENc呈顯著負(fù)相關(guān),Aromo與ENc呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明,GC含量和蛋白質(zhì)親水性對(duì)GDF9基因密碼子偏性有影響。

    2.4不同物種GDF9基因的堿基替代飽和度檢驗(yàn)

    圖1橫坐標(biāo)代表核苷酸轉(zhuǎn)換數(shù)(s)和核苷酸顛換數(shù)(v),縱坐標(biāo)代表基于F84模型建立的遺傳距離。GDF9基因的核苷酸轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)均隨著遺傳距離的增加而變大,且兩者呈線性增加關(guān)系,表明本研究所用的12種哺乳動(dòng)物GDF9基因序列堿基替代未達(dá)到飽和,可進(jìn)行下一步的聚類分析。

    2.5GDF9基因的聚類分析

    由圖2可知,12種哺乳動(dòng)物共分為三大類:一類是偶蹄目家牛、牦牛、綿羊、山羊和野豬;一類是靈長(zhǎng)目蘇門答臘猩猩、人、普通狨猴和食肉目家貓、家犬;另一類是嚙齒目小家鼠和褐家鼠,其中靈長(zhǎng)目和食肉目的親緣關(guān)系較近,而偶蹄目、靈長(zhǎng)目、食肉目與嚙齒目的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),其中類間的最大距離標(biāo)準(zhǔn)化是25。由圖3可知,偶蹄目和食肉目親緣關(guān)系較近,二者與靈長(zhǎng)目親緣關(guān)系較近,嚙齒目與其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2種不同方法構(gòu)建的聚類結(jié)果不一致,但結(jié)合其密碼子偏性指標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn),親緣關(guān)系較近的物種,其密碼子使用偏好性一致。

    3討論

    密碼子偏好性的研究對(duì)了解物種起源于進(jìn)化、目的基因的改造、 推測(cè)未知基因表達(dá)水平及預(yù)測(cè)目的基因最佳宿主奠定了理論基礎(chǔ)[17-18],同時(shí)為轉(zhuǎn)基因研究中的甲基化能否引起基因表達(dá)量下降或基因沉默提供參考[19]。本研究所選12種哺乳動(dòng)物GDF9基因的有效密碼子數(shù)值在49.57~53.42區(qū)間波動(dòng),密碼子使用上存在一定的偏好性;在堿基序列組成成分上,9種哺乳動(dòng)物的AT含量高于GC含量,但密碼子第3位的GC含量(GC3s)與GC含量存在差異;12種哺乳動(dòng)物有25個(gè)密碼子的同義密碼子相對(duì)使用度>1.5,其中以GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT為主,說(shuō)明GDF9基因偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。因此推斷堿基組成是造成密碼子偏好性的原因之一,這與姜艷等的研究結(jié)果[20]一致。

    目前的研究認(rèn)為,堿基差異(突變)、自然選擇、cDNA序列長(zhǎng)度和tRNA豐度對(duì)密碼子偏好性均有影響[21]。Chen等發(fā)現(xiàn)自然選擇造成的密碼子變化可能提高基因表達(dá)效率和多肽折疊動(dòng)力,但這只發(fā)生在特定的基因中,甚至在特定基因的特定位置中[22]。本研究選取不同哺乳動(dòng)物相同基因,可忽略蛋白自然選擇和tRNA豐度等影響,通過(guò)分析密碼子使用偏性的影響因素,發(fā)現(xiàn)GC含量和蛋白質(zhì)親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素。已有研究表明,GC含量對(duì)同義密碼子使用偏好性有重要影響,密碼子偏好性越強(qiáng)的基因越趨向于使用以G或C結(jié)尾的密碼子,且密碼子偏好性的變化往往由第3位密碼子決定[23]。因子在不存在自然選擇壓力的情況下,一定方向的突變壓力對(duì)第3位堿基種類會(huì)有影響[24]。

    本研究基于密碼子使用偏性的聚類與基于最小進(jìn)化法形成的聚類相比,發(fā)現(xiàn)同一目下的物種聚為一類,即親緣關(guān)系較近。但2種聚類結(jié)果存在差異,主要集中在前者將靈長(zhǎng)目和食肉目聚為一類,后者將偶蹄目和食肉目聚為一類。這種聚類結(jié)果不一致的現(xiàn)象在植物和其他動(dòng)物[25-28]中均出現(xiàn)過(guò),提示我們?cè)诮窈蟮难芯恐?,?duì)物種的分離不能僅局限于對(duì)堿基組成的分析??山Y(jié)合密碼子使用偏性和編碼區(qū)序列總和的結(jié)果進(jìn)行分析,這樣可為提高分類結(jié)果準(zhǔn)確度提供重要參考。GDF9基因偏好使用的密碼子的確定有利于其轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的建立,并對(duì)其目的基因的改造和最優(yōu)密碼子的優(yōu)化等提供理論基礎(chǔ)。

    4結(jié)論

    本研究通過(guò)分析12種哺乳動(dòng)物GDF9基因密碼子使用模式,發(fā)現(xiàn)不同哺乳動(dòng)物間密碼子選擇偏性具有差異性,確定該基因的最優(yōu)密碼子為GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT,且偏愛使用A或T結(jié)尾的密碼子。GC含量和蛋白質(zhì)親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素?;诿艽a子使用偏性的聚類與基于最小進(jìn)化法形成的聚類均表明親緣關(guān)系相近的物種間的密碼子使用特征較為一致,但2種方法構(gòu)建的聚類結(jié)果存在差異。

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