谷子蔗糖合成酶基因家族鑒定及生物信息學(xué)分析

王凌云+郭明+趙艷

摘要：蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuS）是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，在植物的代謝反應(yīng)中起重要作用。以谷子基因組數(shù)據(jù)庫為平臺(tái)，借用生物信息學(xué)手段對谷子SiSuS基因家族進(jìn)行挖掘和分析。結(jié)果表明，谷子的SiSuS基因家族包括9個(gè)基因，它們不均勻地分布在5條染色體上。該家族氨基酸序列長度為809～1 088 aa，外顯子數(shù)目為10～16個(gè)，大多數(shù)蛋白質(zhì)為弱酸性。谷子SiSuS的氨基酸序列具有9個(gè)保守基序；進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，谷子、水稻、高粱SiSuS蛋白聚在一起。

關(guān)鍵詞：谷子；蔗糖合成酶；SiSuS基因；生物信息學(xué)分析；蛋白結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S515.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0030-04

蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuS）作為植物蔗糖代謝的重要酶之一，對植物的生長具有重要作用。蔗糖合成酶能夠參與蔗糖的代謝和調(diào)控蔗糖的輸入，影響細(xì)胞分化與纖維壁的形成，調(diào)節(jié)淀粉的合成，對作物產(chǎn)量和品質(zhì)調(diào)控都有重要的意義[1]。蔗糖合成酶基因廣泛存在于高等植物中，目前已經(jīng)從馬鈴薯、胡蘿卜、玉米、柑橘等大量植物中獲得SuS基因[2]。大量研究顯示，SuS是一個(gè)小的基因家族，在大多數(shù)植物中至少含有3個(gè)SuS基因，擬南芥、萵苣、橡樹均含有6個(gè)SuS基因[3-5]，玉米中至少有5個(gè)SuS基因，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[JP3]9個(gè)SuS基因[6]，煙草中發(fā)現(xiàn)14個(gè)SuS基因[7]，但是對谷子SuS基因的研究尚未見報(bào)道，因此，本研究以谷子為對象進(jìn)行分析。

谷子（Setaria italica）作為我國傳統(tǒng)糧食作物，種植面積廣，同時(shí)營養(yǎng)價(jià)值高，有“百谷之長”的美譽(yù)[8]。谷子基因組小且為二倍體，與水稻、高粱、玉米共線性高，是禾本科基因組研究的模式植物之一，也是研究C4植物的模式植物。目前谷子的全基因組測序已經(jīng)完成，這為谷子分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒定谷子SuS基因家族，并對該家族序列及蛋白系統(tǒng)進(jìn)行比較分析，對了解SiSuS基因家族在谷子蔗糖代謝中的作用具有非常重要的意義。

1材料與方法

1.1谷子SuS基因的鑒定及序列分析

首先在Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）[9]中下載SuS家族的隱馬氏模型文件（Pfam號碼：PF00862），從Gramene（http：//www.gramene.org/）中輸入Pfam號碼進(jìn)行相似性搜索，找到與谷子相關(guān)基因的ID及其蛋白序列，進(jìn)行重復(fù)性比對，除去重復(fù)項(xiàng)和冗余，得到無重復(fù)的基因、轉(zhuǎn)錄本、蛋白ID以及蛋白序列和外顯子數(shù)量，共得到9條蛋白并命名為SiSuS1～SiSuS9。

利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）網(wǎng)站[10-11]對蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢測。在ProtParam網(wǎng)站（http：//web.expasy. org/protparam/）對谷子SiSuS蛋白的相關(guān)信息（分子量、氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)）進(jìn)行分析[12]。

1.2染色體定位

結(jié)合谷子基因組數(shù)據(jù)庫中的信息，從Ensembl Plants（http：//plants. ensembl.org/Setaria_italica/Info/Index）中查詢谷子染色體的長度，使用Adobe illustrator CS5軟件繪制基因在染色體上的相對位置。

1.3SiSuS基因家族蛋白的繪制

分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的位置，使用PROSITE在線網(wǎng)站（http：//prosite.expasy.org/）[13]分析9個(gè)SiSuS蛋白序列，得出每個(gè)蛋白相應(yīng)的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域、糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase）結(jié)構(gòu)域、蔗糖磷酸合成酶（sucrose-phosphate synthase）結(jié)構(gòu)域的位置。

[HTK]1.4SiSuS基因家族進(jìn)化樹的繪制及內(nèi)含子、外顯子的結(jié)構(gòu)分析[HT]

利用Clustal X[14]對比所得到的SiSuS蛋白序列并下載分析結(jié)果。使用MEGA 6.0軟件采用鄰接法（NJ法）繪制進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000。將Fasta格式的谷子SiSuS基因編碼的核苷酸序列和相應(yīng)的全核苷酸序列，通過GSD軟件[15]繪制谷子SiSuS基因的內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)模式圖。

1.5谷子SiSuS基因編碼的序列分析及模體分布

利用MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgibin/meme.cgi）[16]將Fasta格式的谷子SiSuS基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行序列分析及保守性基序分布，設(shè)定序列長度范圍為20～300 aa。

1.6谷子、高粱和水稻SuS基因家族的比較分析

將獲得的谷子、高粱和水稻SuS基因的氨基酸序列以Fasta格式保存，采用“1.3”節(jié)的方法繪制這3種植物SuS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，對不同物種SuS基因家族進(jìn)行比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1谷子SiSuS基因家族的鑒定及序列分析[HT]

由表1可知，通過對谷子基因組數(shù)據(jù)庫的檢索共鑒定出9個(gè)SuS基因，命名為SiSuS1～SiSuS9。分析9個(gè)SiSuS蛋白序列發(fā)現(xiàn)不同蛋白差異很大，SiSuS蛋白的氨基酸個(gè)數(shù)范圍為809～1 088 aa，分子量范圍為92.34～120.00 ku，等電點(diǎn)范圍為5.88～7.49，基因含有10～16個(gè)外顯子。從蛋白的基本特點(diǎn)可知，SiSuS蛋白無論從序列的長度還是蛋白的特性變化都很大，表示該基因家族蛋白執(zhí)行不同的功能。值得注意的是，多數(shù)SiSuS蛋白的等電點(diǎn)小于7.00，表示多數(shù)SiSuS基因可能編碼弱酸性蛋白，在酸性的亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。endprint

2.2谷子SiSuS基因家族內(nèi)含子、外顯子的分析

為進(jìn)一步研究SiSuS基因的特性，使用GSDS 2.0軟件繪制SiSuS基因的結(jié)構(gòu)模式圖，得到谷子SiSuS基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。由圖1可見，所有的SiSuS基因都含有內(nèi)含子，除SiSuS7基因含有9個(gè)內(nèi)含子外，其他8個(gè)基因的內(nèi)含子數(shù)均大于10，SiSuS3基因的內(nèi)含子最多，含有15個(gè)內(nèi)含子。由此可知，SiSuS基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。

2.3谷子SiSuS基因染色體定位

由圖2可知，SiSuS基因在染色體上分布不均勻，在谷子的9條染色體中除2、3、7、8號染色體外，其余染色體上均含有SiSuS基因。5號、6號染色體上各只有1個(gè)SiSuS基因；1號、9號染色體上各含有2個(gè)SiSuS基因；4號染色體上含有3個(gè)SiSuS基因，數(shù)量最多。其中，除基因SiSuS6、SiSuS4、SiSuS5位于染色體的中上端外，其余基因均位于染色體的下端。

2.4谷子SiSuS蛋白的進(jìn)化樹與結(jié)構(gòu)域分析

運(yùn)用MAGA 5.1軟件分析谷子9個(gè)SiSuS蛋白的進(jìn)化，繪制出SiSuS蛋白進(jìn)化樹（圖3-a），9個(gè)SiSuS蛋白被明顯地分成了2組（組一、組二），其中，SiSuS3、SiSuS4、SiSuS7、SiASuS8、SiSuS9蛋白聚為組一，組一可以進(jìn)一步被分為3組。SiSuS1、SiSuS2、SiSuS5、SiSuS6蛋白聚在組二，組二也可以進(jìn)一步被分成3組。組一含SiSuS蛋白較多，約有55.5%的SuS蛋白位于組一。

利用PROSOTE在線網(wǎng)站分析每個(gè)SiSuS蛋白的結(jié)構(gòu)域（圖3-b），所有谷子SiSuS蛋白都含有植物特異的糖苷基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域，部分蛋白含有蔗糖磷酸合成酶結(jié)構(gòu)域。其中，SiSuS3、SiSuS4、SiSuS7、SiASuS8、SiSuS9蛋白均含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即糖苷基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域、蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域，SiSuS1、SiSuS2、SiSuS5、SiSuS6蛋白不僅含有糖苷基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域、蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域，也含有蔗糖磷酸合成酶結(jié)構(gòu)域。蛋白的進(jìn)化樹和結(jié)構(gòu)域分組一致，即含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白都聚集于組一，含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白都聚集于組二，表明蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化的統(tǒng)一性。

2.5谷子SiSuS蛋白的序列分析及模體分布

模體（motif）是序列中局部的保守區(qū)域。進(jìn)一步分析谷子的9個(gè)SiSuS蛋白結(jié)構(gòu)域，利用MEME對SiSuS蛋白進(jìn)行基序分析，設(shè)定序列長度為20～300 aa，設(shè)定大范圍的長度序列可多樣性搜索蛋白的模體序列。由表2可知，SiSuS蛋白3個(gè)結(jié)構(gòu)域又可以細(xì)分為9個(gè)基序，9條序列氨基酸個(gè)數(shù)范圍在55～200 aa之間。其中，motif1、motif3、motif4、motif7、motif9 5個(gè)保守基序包含的氨基酸數(shù)量均大于100 aa，基序motif 2、motif 5包含的氨基酸數(shù)量較少，均為55 aa。通過軟件分析得出motif 3、motif4、motif7、motif8共同組成了谷子蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域，motif1、motif2、motif5、motif6共同組成了糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，motif 9構(gòu)成了蔗糖磷酸合成酶結(jié)構(gòu)域。

進(jìn)一步分析谷子SiSuS蛋白9個(gè)基序的保守程度（圖4-a），在相同部位蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域中SiSuS3、SiSuS4、SiSuS7、SiSuS8、SiSuS9蛋白含有motif 3，SiSuS1、SiSuS2、SiSuS5、SiSuS6則含有motif 7、motif 4、motif 8，這表明該蛋白序列可能存在缺失。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)motif中motif 8的保守性較高，保守比例為71.4%；而含200個(gè)氨基酸的motif 3保守性最低，其中許多位置的氨基酸多樣性程度較高，其保守比例僅為42%（圖4-b）。

2.6谷子、高粱、水稻SuS基因家族進(jìn)化樹比較

為了更深入研究谷子SuS基因家族的進(jìn)化關(guān)系，選取高粱、水稻SuS與谷子SuS進(jìn)行比較和分析。其中，高粱和水稻的基因均為9個(gè)，共27個(gè)SuS基因。如圖5所示，27個(gè)基因分成了4個(gè)分支，命名為Class A～Class D。除Class C亞支含有2種植物的SuS基因外，其他3個(gè)亞支都含有3種植物（高梁、水稻、谷子）的SuS基因；Class A亞支中SuS基因最多，有10個(gè)基因，Class C亞支中SuS基因最少，僅有2個(gè)基因。通過對谷子、水稻、高粱SuS基因的進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)9對物種間的直系同源基因，1對水稻的旁系同源基因，約占所有基因的74.1%，表明這些基因在谷子、水稻和高粱基因組中，按照各自物種的特異方式進(jìn)行了擴(kuò)展，這種現(xiàn)象在其他植物基因家族中也普遍存在。

3討論與結(jié)論

長發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。1955年Cardini等首次在小麥胚芽中發(fā)現(xiàn)了蔗糖合成酶[17]，自此以后蔗糖合成酶基因從多種植物中分離得到，其中多數(shù)為玉米、水稻等淀粉儲(chǔ)存植物，在擬南芥、煙草等蔗糖儲(chǔ)存植物中也相繼獲得。谷子是我國傳統(tǒng)的淀粉植物，也是C4植物的模式植物，但是目前還沒有對其SuS基因家族進(jìn)行系統(tǒng)研究和分析的報(bào)道，基于此，本研究開展了谷子全基因掃描，深入分析SuS基因家族的特征、特性。

在許多植物中蔗糖合成酶以不同亞型形式存在，這些亞型至少由2個(gè)基因編碼，甚至更多，玉米中至少有5個(gè)SuS基因，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9個(gè)SuS基因[18]。這些基因的結(jié)構(gòu)、功能和染色體定位各不相同，白楊中蔗糖合成酶基因家族的15個(gè)成員分別在2、4、6、15、17、18號染色體上[19]，谷子中蔗糖合酶基因分別在1、4、5、6、9號染色體上。蔗糖合成酶在植物中催化蔗糖+二磷酸尿（嘧啶）苷果糖+尿嘧啶核苷-5′-二磷酸葡萄糖可逆反應(yīng)，已經(jīng)公認(rèn)蔗糖合成酶基因含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域：蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域、糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，在擬南芥中所有的AtSUS家族都有這2個(gè)結(jié)構(gòu)域，本研究的結(jié)果與之相符。endprint

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展和完善，植物蔗糖合成酶基因家族的進(jìn)化與分類研究備受關(guān)注。進(jìn)化分析表明，SuS基因家族可分為4族：單子葉族、雙子葉SuS1族、雙子葉SuS2族、NG族。本研究初步分析了谷子、水稻、高粱SuS基因家族的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，這些基因的同源性高，可為深入研究SuS家族對谷子生長調(diào)控的機(jī)制提供參考，對深入揭示蔗糖合成酶在谷子的生物學(xué)功能以及了解整個(gè)糖代謝過程具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Koch K E，Wu Y，Xu J. Sugar and metabolic regulation of genes for sucrose metabolism：potential influence of maize sucrose synthase and soluble invertase responses on carbon partitioning and sugar sensing[J]. Journal of Experimental Botany，1996，47（301）：1179-1185.

[2]盧合全，沈法富，劉凌霄，等. 植物蔗糖合成酶功能與分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，21（7）：34-37.

[3]Baud S，Vaultier M N，Rochat C. Structure and expression profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55（396）：397-409.

[4]Horst I，Welham T，Kelly S，et al. TILLING mutants of Lotus japonicus reveal that nitrogen assimilation and fixation can occur in the absence of nodule-enhanced sucrose synthase[J]. Plant Physiology，2007，144（2）：806-820.

[5]Xiao X，Tang C，F(xiàn)ang Y，et al. Structure and expression profile of the sucrose synthase gene family in the rubber tree：indicative of roles in stress responseand sucroseutilizationin the laticifers[J]. FEBS Journal，2014，281（1）：291-305.

[6]Cho J I，Kim H B，Kim C Y，et al. Identification and characterization of the duplicate rice sucrose synthase genes which are associated with the plasma membrane[J]. Molecules andCells，2011，31（6）：553-561.

[7]Wang Z，Wei P，Wu M，et al. Analysis of the sucrose synthase gene family in tobacco：structure，phylogeny，and expression patterns[J]. Planta，2015，242（1）：153-166.

[8]陳衛(wèi)軍，魏益民，張國權(quán)，等. 國內(nèi)外谷子的研究現(xiàn)狀[J]. 雜糧作物，2000，20（3）：27-29.

[9]Punta M，Coggill P C，Eberhardt R Y，et al. The Pfam protein families database[J]. Nucleic Acids Research，2012，40（1）：290-301.

[10]Schultz J，Milpetz F，Bork P，et al. SMART，a simple modular architecture research tool：identification of signaling domains[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（11）：5857-5864.

[11]Marchler-Bauer A，Anderson J B，Chitsaz F，et al. CDD：specific functional annotation with the Conserved Domain Database[J]. Nucleic Acids Research，2009，37：205-210.

[12]Wang Y，Deng D，Shi Y，et al. Diversification，phylogeny and evolution of auxin response factor （ARF） family：insights gained from analyzing maize ARF genes[J]. Molecular Biology Reports，2012，39（3）：2401-2415.

[13]Sigrist C J，Cerutti L，de Castro E，et al. PROSITE，a protein domain database for functional characterization and annotation[J]. Nucleic Acids Research，2010，38：161-166.

[14]Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al. Clustal W and clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics，2007，23（21）：2947-2948.

[15]Kiefer F，Arnold K，Künzli M，et al. The SWISS-MODEL repository and associated resources[J]. Nucleic Acids Research，2009，37：387-392.

[16]Bailey T L，Boden M，Buske F A，et al. MEME SUITE：tools for motif discovery and searching[J]. Nucleic Acids Research，2009，37：202-208.

[17]Cardini C E，Leloir L F，Chiriboga J. The biosynthesis of sucrose[J]. Journal of Biological Chemistry，1955，214（1）：149-155.

[18]An X，Chen Z，Wang J，et al. Identification and characterization of the Populus sucrose synthase gene family[J]. Gene，2014，539（1）：58-67.

[19]Zhang D Q，Xu B H，Yang X H，et al. The sucrose synthase gene family in Populus：structure，expression，and evolution[J]. Tree Genetics & Genomes，2011，7（3）：443-456.endprint