基因組學(xué)技術(shù)及其在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用綜述

張思源　歐江濤　王資生

摘要：自人類基因組計(jì)劃完成以來，基因組學(xué)進(jìn)入功能研究時(shí)代?；蚪M研究技術(shù)引入水產(chǎn)動(dòng)物的研究后，推進(jìn)了水產(chǎn)動(dòng)物基因組的結(jié)構(gòu)和功能研究，解析和詮釋了水產(chǎn)動(dòng)物生物學(xué)現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制，在遺傳育種、疾病防治和醫(yī)藥等方面的研究應(yīng)用也取得較大進(jìn)展。本文綜述了基因組學(xué)研究中的測序技術(shù)、DNA分子標(biāo)記技術(shù)、基因芯片、RNAi和基因編輯等技術(shù)的研究現(xiàn)狀，總結(jié)這些技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究應(yīng)用，分析其在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，為水產(chǎn)動(dòng)物的發(fā)育、繁殖和抗逆育種等研究應(yīng)用提供重要基因資源基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：基因組；測序技術(shù)；功能基因組學(xué)；水產(chǎn)動(dòng)物

中圖分類號： Q789；S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0001-06

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，基因則是細(xì)胞進(jìn)行遺傳活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。基因具有一致性、穩(wěn)定性和連續(xù)性；不同的細(xì)胞、基因存在個(gè)體差異性，研究基因遺傳信息的差異對理解生命演變具有重要意義[1]?；蚪M學(xué)的研究分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)，及其延伸學(xué)科為轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等?；蚪M學(xué)研究工具有研究基因組結(jié)構(gòu)的測序技術(shù)、DNA分子標(biāo)記技術(shù)和基因芯片等，研究功能基因的技術(shù)有轉(zhuǎn)基因、基因敲除、反義技術(shù)、RNAi技術(shù)和基因編輯技術(shù)等。測序技術(shù)為基因組研究提供大量準(zhǔn)確精細(xì)的數(shù)據(jù)，推動(dòng)了基因組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。DNA分子標(biāo)記技術(shù)和基因芯片主要應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建，對重要經(jīng)濟(jì)性狀基因的定位和圖位克隆，給基因組結(jié)構(gòu)和功能研究提供強(qiáng)大的輔助育種基礎(chǔ)?；蚯贸夹g(shù)、小分子干擾RNA、反義技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、抗體技術(shù)和基因編輯技術(shù)等是對一個(gè)或多個(gè)靶基因的研究，還有針對多重靶標(biāo)的化學(xué)基因組學(xué)；這些都是在了解基因組結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對基因組的功能驗(yàn)證和開發(fā)利用，同時(shí)基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也開始由實(shí)驗(yàn)室研究走向染色體疾病檢測、病毒與細(xì)菌鑒定和腫瘤檢測等臨床應(yīng)用。

蓬勃發(fā)展的基因組學(xué)為水產(chǎn)動(dòng)物的研究提供了方向，基因組學(xué)研究技術(shù)也為水產(chǎn)動(dòng)物的基因組結(jié)構(gòu)和功能研究提供了有力工具。人類基因組計(jì)劃完成初始，水產(chǎn)動(dòng)物的基因組研究還停留在關(guān)鍵基因克隆和部分經(jīng)濟(jì)性狀基因的標(biāo)記育種中，隨著測序技術(shù)、DNA分子標(biāo)記和基因敲除等技術(shù)的引入，基因組學(xué)在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究應(yīng)用日新月異，已成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。水產(chǎn)動(dòng)物研究操作方便、與人類基因有許多共同點(diǎn)，因此用作解決遺傳、發(fā)育和免疫等生命相關(guān)科學(xué)問題的模式動(dòng)物?；蚪M學(xué)技術(shù)推進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究，有利于解析和詮釋水產(chǎn)動(dòng)物生物學(xué)現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制[2]。開展重要水產(chǎn)生物功能基因組學(xué)研究，得到與抗病、抗逆、生長、生殖等重要性狀相關(guān)的功能基因，明確這些基因的遺傳基礎(chǔ)、功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，可為水產(chǎn)養(yǎng)殖、抗病育種及生殖調(diào)控提供具有重要應(yīng)用價(jià)值的基因資源。

1基因組測序技術(shù)

1.1測序技術(shù)的研究進(jìn)展

人類基因組計(jì)劃完成以來，成本低、速度快的測序技術(shù)得到飛速發(fā)展，為生命科學(xué)研究作出了卓越貢獻(xiàn)。2000年人類基因組草圖完成時(shí)，僅42個(gè)物種擁有全基因組序列，至2015年在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有774種動(dòng)物和植物具有基因組序列。Sanger等提出雙脫氧鏈合成終止法測序技術(shù)，開啟了全基因組測序時(shí)代，其后基于焦磷酸法和鏈接酶法測序原理的第二代高通量測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)迅速成為了現(xiàn)在研究基因組結(jié)構(gòu)的重要工具；基于單個(gè)分子信號檢測的DNA測序被稱為單分子測序（single molecule sequencing，SMS）或稱為第三代測序（third generation sequencing，TGS）和第四代納米孔測序研究也走入我們的視線[3-4]。各大測序公司都推出自己的平臺，其原理各有不同，并在通量、讀長、準(zhǔn)確度、速度和成本等方面也不相同，但均在基因組測序、重測序、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)等研究中發(fā)揮了重要作用，并逐漸應(yīng)用于個(gè)性化醫(yī)療和遺傳診斷等臨床服務(wù)。目前，主流運(yùn)用的NGS測序技術(shù)中Illumina的測序性價(jià)比高，Roche的測序片段較長，ABI的準(zhǔn)確度相對略有優(yōu)勢，為研究提供了更多選擇。各代測序技術(shù)也在原有的基礎(chǔ)上更新，如Thermo公司最新的NGS系統(tǒng)Ion S5和Ion S5XL在測序時(shí)間、總數(shù)據(jù)量、平均深度以及總讀數(shù)都較其他二代測序技術(shù)突出[5]。第四代納米孔測序，雖然商業(yè)化測試的僅有Oxford Nanopore[6]和GenapSys這2家公司，但其在價(jià)格、通量和時(shí)間等方面的優(yōu)勢，把進(jìn)行個(gè)人基因組測序成為可能。除全基因組測序技術(shù)外，還有一些針對基因組內(nèi)特殊問題專門應(yīng)用的測序技術(shù)，如：Koh等[7]、Ding等[8]分別研發(fā)的Ribose-seq、emRiboSeq和EndoSeq測序技術(shù)，可鑒定和定位在DNA復(fù)制、修復(fù)過程中插入基因組中的核糖核苷酸分子，完善了全基因組序列信息。

通過測序技術(shù)測出一個(gè)物種基因組序列片段，需經(jīng)過組裝拼接，最終獲得該物種基因組序列圖譜，并應(yīng)用于基因組學(xué)研究當(dāng)中，方可全面了解一個(gè)物種的基因組組成、基因調(diào)控和分子進(jìn)化等。根據(jù)某一物種基因組的復(fù)雜程度可分為簡單基因組測序和復(fù)雜基因組測序2類，利用以RAD、GBS技術(shù)為基礎(chǔ)的簡化基因組測序技術(shù)可在極短的時(shí)間內(nèi)開發(fā)出成千上萬的SNP標(biāo)記，是當(dāng)前測序技術(shù)的一種熱門應(yīng)用[9]。測序方法策略有基因組從頭測序、基因組重測序、泛基因組測序，還有針對性較強(qiáng)的線粒體基因組測序、全基因組甲基化測序、外顯子組深度測序等?；蚪M一般測序從基因組水平上對物種的生長、發(fā)育、進(jìn)化、起源等重大問題進(jìn)行研究，將加深我們對物種的認(rèn)識，在新基因的發(fā)現(xiàn)、物種改良等方面發(fā)揮巨大作用；基因組重測序可以尋找出大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、插入缺失位點(diǎn)（insertion deletion，InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（structure variation，SV）和拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）等變異信息，在群體水平上研究物種的進(jìn)化歷史、環(huán)境適應(yīng)性、自然選擇等方面，從而獲得生物群體的遺傳特征，有助于快速發(fā)現(xiàn)與動(dòng)植物重要性狀或人類疾病相關(guān)的重要變異基因等；外顯子組深度測序能夠經(jīng)濟(jì)高效地檢測一個(gè)物種基因組中全部外顯子區(qū)域，最直接體現(xiàn)基因功能，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)的遺傳突變；甲基化組測序可繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)，為疾病發(fā)生與治療的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)；目標(biāo)區(qū)域深度測序是指對感興趣的特定基因組區(qū)域進(jìn)行高通量測序，尋找與各種復(fù)雜疾病相關(guān)的致病基因和易感基因[10]。endprint

1.2測序技術(shù)在基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

目前，研究者已經(jīng)對40多種常見水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行基因組測序（表1），為水產(chǎn)動(dòng)物研究與應(yīng)用提供了一大批與生長、發(fā)育、繁殖、營養(yǎng)、免疫、抗逆等相關(guān)的候選基因，同時(shí)全基因組的功能注釋也為水產(chǎn)生物物種特有生物學(xué)現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制解析提供了全方位基因?qū)用娴纳镄畔⒆C據(jù)，豐富了水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳資源，也為物種進(jìn)化研究提供參考。由于水產(chǎn)動(dòng)物基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，重復(fù)序列高，經(jīng)濟(jì)、快捷、目的性較強(qiáng)的簡化基因組測序和外顯子組深度測序?qū)⑹撬a(chǎn)動(dòng)物基因組研究的重要方法之一。

抗逆是水產(chǎn)動(dòng)物基因組應(yīng)用研究的一大熱點(diǎn)，同時(shí)也是育種的新思路。Colbourne等對水蚤基因組的測序，使水蚤成為首個(gè)完成基因組測序的甲殼類動(dòng)物[11]。研究顯示，水蚤基因組大小僅200 Mb，卻包含30 907個(gè)基因，大約是人類基因的1.3倍，超過1/3的基因?yàn)樗槭老邓?dú)有；分析認(rèn)為水蚤基因組內(nèi)含有較少的非編碼DNA和較高的基因重復(fù)率，使其擁有較多的基因。功能研究水蚤基因家族共表達(dá)及其在代謝信號通路中的作用證實(shí)重復(fù)并非隨機(jī)分布，其中大部分旁系同源基因在不同環(huán)境中具有不同的表達(dá)模式；分析水蚤獨(dú)有基因發(fā)現(xiàn)這些基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境變化極其敏感，為研究生活在淡水中的生物如何適應(yīng)環(huán)境變化提供了分子基礎(chǔ)。牡蠣維持調(diào)控近海和內(nèi)灣生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，是潮間帶極端環(huán)境的代表物種，Zhang等采用fosmid合并策略（針對高度復(fù)雜性和多態(tài)性的基因組）測序并組裝了太平洋牡蠣基因組約559 Mb，預(yù)測擁有 28 027 個(gè)基因[12]。對數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)針對環(huán)境壓力變化熱休克蛋白70有助于牡蠣耐受高溫，存在以48個(gè)凋亡抑制蛋白基因?yàn)橹鞯目沟蛲鱿到y(tǒng)，這些基因和旁系同源基因通過調(diào)控自身的基因表達(dá)，使得牡蠣能較好地適應(yīng)和應(yīng)對環(huán)境壓力；發(fā)育方面研究顯示與機(jī)體體節(jié)發(fā)育相關(guān)的Hox基因簇被破壞；同時(shí)該團(tuán)隊(duì)也對貝殼的形成進(jìn)行研究，在貝殼中鑒定出259種貝殼蛋白，大部分為非分泌性蛋白，貝殼基質(zhì)與動(dòng)物的結(jié)締組織、基底膜的細(xì)胞外基質(zhì)具有相似性，如血細(xì)胞及外來體參與調(diào)控纖絲的形成。

大數(shù)據(jù)的基因組對免疫應(yīng)答和免疫細(xì)胞信號傳導(dǎo)等免疫學(xué)基礎(chǔ)研究產(chǎn)生很大的影響，并為疾病診斷與治療提供新線索。斑馬魚是一種常用的重要模式生物，其透明胚胎特別適合進(jìn)行發(fā)育，Howe等研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人類共享約70%的蛋白編碼基因，且與人類疾病相關(guān)基因中有84%可以在斑馬魚中找到對應(yīng)基因，目前在斑馬魚中已經(jīng)鑒定出與人類疾病有關(guān)的3 188個(gè)基因突變[13-14]。水產(chǎn)養(yǎng)殖的黃魚極易受到細(xì)菌、病毒和寄生蟲傳染，黃魚抗病力下降顯著地影響了水產(chǎn)業(yè)，Wu等繪制了大黃魚基因組序列草圖，并證實(shí)受到正選擇作用的快速進(jìn)化基因富集在與先天免疫相關(guān)的一些信號通路上，并鑒別出一些先天防御基因如Toll樣受體、白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子等在感染后顯著下調(diào)，揭示出大黃魚具有發(fā)育良好的先天免疫系統(tǒng)[15]。

漫長的歷史進(jìn)化過程中，物種內(nèi)和物種之間的基因組存在差異，研究這些差異和其穩(wěn)定的遺傳是研究進(jìn)化的核心。從事比較基因組學(xué)研究的Simakov等對帽貝（Lottia gigantea）、海蠕蟲（Capitella teleta）和水蛭（Helobdella robusta）3個(gè)冠輪動(dòng)物（Lophotrochozoans）進(jìn)行基因組測序，研究小組還開發(fā)用于快速簡便搜索基因組間相似性的計(jì)算工具來比較分析各物種基因組的差異，成功追蹤17個(gè)結(jié)構(gòu)相似對稱動(dòng)物共同祖先的“祖先連鎖群”（ancestral linkage groups），分析功能并測試進(jìn)化過程的假說[16]。

2DNA分子標(biāo)記和生物芯片技術(shù)

2.1DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究進(jìn)展

DNA分子標(biāo)記能夠反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，是重要的生物標(biāo)記之一，具有成本低廉、操作簡單和信息量大等特點(diǎn)，是開展遺傳作圖、關(guān)聯(lián)分析、群體遺傳分析以及生態(tài)多樣性分析等研究的基礎(chǔ)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)分為：基于DNA和DNA雜交的RFLP、DAF和原位雜交等；基于PCR技術(shù)的RAPD、AFLP、STS、SCAR、SRAP和RP-PCR等；基于重復(fù)序列為基礎(chǔ)的微衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、SSR、和SRS等；基于DNA測序分析的EST、SNP、CNV和線粒體DNA標(biāo)記等[17-18]。AFLP和SNP位點(diǎn)分布廣泛的特點(diǎn)決定了其在高飽和度遺傳圖譜構(gòu)建中將發(fā)揮重要作用；SSR應(yīng)用廣泛、多態(tài)性高的特點(diǎn)適合于不同家系和群體遺傳圖譜的比較和整合，但須篩選出微衛(wèi)星標(biāo)記，才能在QTL定位和連鎖圖譜構(gòu)建中發(fā)揮更大的作用；EST標(biāo)記和其他遺傳標(biāo)記應(yīng)用將為基因定位與克隆、比較基因組研究和物理圖譜的構(gòu)建起到關(guān)鍵作用；DNA條形編碼技術(shù)可準(zhǔn)確、快速、有效地進(jìn)行物種鑒定；與芯片雜交合用的多樣性序列芯片技術(shù)（diversity arrays technology，DArT）較廣應(yīng)用于基因組型分析研究中[18-19]。分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、重要經(jīng)濟(jì)性狀基因定位、圖位克隆和物種系統(tǒng)發(fā)育等方面。

蝦、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物基因組研究相對滯后，水產(chǎn)動(dòng)物的生長、繁殖、抗逆和抗病等重要數(shù)量性狀研究大多還是依賴DNA分子標(biāo)記技術(shù)。水產(chǎn)動(dòng)物中的分子標(biāo)記研究較多也較成熟，國內(nèi)外學(xué)者利用分子標(biāo)記對水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)和種質(zhì)資源的鑒定[20]，在重要水產(chǎn)動(dòng)物中篩選出重要性狀相關(guān)的功能基因[21-22]，闡明了其中一些重要基因的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，并剖析其相關(guān)遺傳基礎(chǔ)，為生長發(fā)育、生殖調(diào)控、抗病育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖等提供一大批具有重要潛在價(jià)值的基因資源庫。物種進(jìn)化的本質(zhì)是基因組的進(jìn)化，分類學(xué)中可利用DNA分子標(biāo)記精確分析其速度和種屬分類[23-24]，同時(shí)利用分子標(biāo)記在有關(guān)物種間進(jìn)行遺傳或物理作圖的比較基因組學(xué)研究；例如，對斑馬魚基因組研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人類大約70%的蛋白編碼基因相似，并且已確定的人類疾病相關(guān)基因中有84%可以在斑馬魚中找到對應(yīng)基因[13]。Jiao等建立貝類全基因組選擇育種分析評估系統(tǒng)時(shí)，利用種群、個(gè)體間的遺傳標(biāo)記分型技術(shù)檢測變異后與性狀間進(jìn)行連鎖，研發(fā)了低成本、高通量遺傳標(biāo)記分型技術(shù)[25]。endprint

2.2基因芯片技術(shù)及其在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用

在DNA雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的基因芯片（genechip）又稱DNA微陣列或DNA芯片，是研究最深入、實(shí)用性最強(qiáng)的生物芯片之一，目前已經(jīng)得到了極大的發(fā)展與應(yīng)用。根據(jù)所用探針的差異分為寡核苷酸陣列和cDNA微陣列兩大類[26-27]?；蛐酒瑫r(shí)檢測大量基因的相對量，高通量研究基因組上的全部基因，已從基因表達(dá)譜發(fā)展到SNP譜、CNV譜和功能基因組分析的許多方面。新研究的有Illumina公司的微珠布放法、Applied Biosystems的qPCR array和Nanogen公司的微電子芯片等，其中qPCR array針對性強(qiáng)、可準(zhǔn)確可靠研究某一生物學(xué)通路的基因，在水產(chǎn)動(dòng)物的免疫防御中有較好利用。用于基因組研究的主要是SNP和CNV芯片，Illumina公司憑借自己開發(fā)的GoldenGate技術(shù)和infinium專利技術(shù)開發(fā)的SNP芯片提供靈活快捷的定制服務(wù)，適用于大樣本量分析。在芯片的技術(shù)水平、芯片的種類以及覆蓋SNP位點(diǎn)的數(shù)量遠(yuǎn)超Affymetrix公司的SNP芯片。2家公司SNP芯片都可用于CNV分析，但I(xiàn)llumina芯片因覆蓋位點(diǎn)數(shù)量較多，所以在CNV分析中可提供更高分辨率的CNV數(shù)據(jù)[28]。同時(shí)，Illumina光纖微珠芯片平臺可穩(wěn)定地高通量分析不同條件下細(xì)胞、組織等樣品間的DNA甲基化差異。

生物芯片技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的免疫調(diào)控和病原檢測等領(lǐng)域，具有高度的平臺化、多元化、微型化和自動(dòng)化等優(yōu)勢，可以在無損傷前提下對養(yǎng)殖動(dòng)物進(jìn)行研究。針對目前由多種病原共同作用引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病，生物芯片可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品多種病原的集成檢測，根據(jù)檢測結(jié)果即可對疾病作出較為準(zhǔn)確的診斷，對疾病的防控具有重大意義。其中，基因芯片技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物疾病病原的檢測應(yīng)用研究中尚處于初步階段，僅在一些常見的、危害較大的細(xì)菌、病毒性疾病檢測上有所應(yīng)用。Thanasaksiri等使用微陣列分析注射不同量聚肌苷酸胞苷酸poly（I ∶[KG-*3]C）的牙鲆在15 ℃和25 ℃下基因表達(dá)的差別，結(jié)果顯示253個(gè)基因有差異表達(dá)，其中部分是Ⅰ型干擾素（IFN）和炎癥相關(guān)基因[29]。Dahle等利用高密度寡核苷酸微陣列對大西洋鮭魚呼腸孤病毒（piscine orthoreovirus，PRV）感染的血細(xì)胞免疫應(yīng)答基因表達(dá)進(jìn)行了分析[30]。

3基因功能研究重要技術(shù)與應(yīng)用

3.1傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因和基因打靶是早期應(yīng)用于基因功能的研究技術(shù)?；蚪M測序得到大量結(jié)構(gòu)已知而功能未知的基因，隨后功能基因組學(xué)研究開啟，對目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，從整體觀察目標(biāo)生物推測基因功能的基因打靶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，已成為研究功能基因組最有效和最直接的方法之一?；虼虬械难芯坎呗钥煞譃椋和耆蛱蕹牟呗?、基因捕獲、精細(xì)突變、條件性基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶、染色體組大片段的刪除和重排、誘導(dǎo)性基因打靶和基因敲入等。利用基因捕獲建立攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫，從而節(jié)省篩選染色體組文庫、構(gòu)建載體的工作及費(fèi)用，更有效和更迅速地進(jìn)行染色體功能分析；精細(xì)突變的引入有打了就走策略、雙置換法、“標(biāo)記和置換”法和利用Cre-LoxP系統(tǒng)引入點(diǎn)突變；時(shí)空特異性基因打靶特異的時(shí)間和空間調(diào)控，便于研究基因剔除的不同發(fā)育階段的研究?；虼虬锌赏ㄟ^建立相應(yīng)疾病模型，為疾病的基因治療提供科學(xué)理論依據(jù)，還可應(yīng)用與生物改造和新物種的培育中[31-32]。

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使目標(biāo)物種獲得特定基因所關(guān)聯(lián)的性狀，也是目前水產(chǎn)動(dòng)物育種中的常見方法。基因的轉(zhuǎn)移有電轉(zhuǎn)法、精子介導(dǎo)法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法和顯微注射法等，其中應(yīng)用最廣的是顯微注射法。水產(chǎn)動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因研究主要是在其繁殖與育種過程中把牛羊等大動(dòng)物的生長激素基因轉(zhuǎn)移到水產(chǎn)動(dòng)物受精卵中，以促進(jìn)快速生長；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在疾病預(yù)防中應(yīng)用較廣，如溶菌酶基因被導(dǎo)入到大西洋鮭魚中以使其獲得抗病特性[33]。除天然編碼基因用于轉(zhuǎn)基因之外，更高效的“分子設(shè)計(jì)”和“合成生物學(xué)”也開始應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因育種[34]。

3.2RNAi技術(shù)

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是雙鏈RNA（dsRNA）產(chǎn)生多個(gè)小干擾RNA（small interferencing RNA，siRNA）介導(dǎo)對同源靶mRNA的降解誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大的特異性的基因表達(dá)抑制或沉默作用，是生物進(jìn)化過程中產(chǎn)生的自我保護(hù)機(jī)制。其中，siRNA瞬間應(yīng)答，可持續(xù)幾小時(shí)甚至幾天，或應(yīng)用可誘導(dǎo)組織特異性啟動(dòng)子產(chǎn)生siRNA從而達(dá)到更穩(wěn)定的突變體等，這些特點(diǎn)，使RNAi更具優(yōu)勢，應(yīng)用更廣。通過RNAi系統(tǒng)，細(xì)胞可以清除當(dāng)前細(xì)胞不需要的或外源的mRNA，以及畸變的RNA，從而提高細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)效率，抑制病毒、“跳躍”因子等可能對細(xì)胞基因穩(wěn)定性造成傷害的基因成分[35-36]。RNAi在基因組水平上主要用來篩選確定改變轉(zhuǎn)基因表達(dá)或?qū)е履骋惶禺愋员硇偷幕?。RNAi技術(shù)可經(jīng)濟(jì)、快捷的進(jìn)行基因功能分析，同時(shí)也可以對基因數(shù)據(jù)庫中功能尚不清楚的基因或序列進(jìn)行功能分類或初步分類，是后基因組學(xué)時(shí)代的一項(xiàng)研究基因功能的重要工具。使用合適的啟動(dòng)子，RNAi在特定細(xì)胞類型中可消除或減弱特異基因的活性，這一策略用于發(fā)育過程的不同階段，可精確進(jìn)行指導(dǎo)各種組織特異性基因表達(dá)沉默[35，37]。

作為一項(xiàng)反向遺傳學(xué)技術(shù)，RNAi技術(shù)與反義寡核苷酸技術(shù)相比具有用量少、抑制基因表達(dá)效果明顯等優(yōu)點(diǎn)，且相比基因敲除技術(shù)可在較短的試驗(yàn)周期內(nèi)了解基因的功能，在基因功能研究這一復(fù)雜的工程中，專一性和干擾活力較高的RNAi技術(shù)對水產(chǎn)動(dòng)物疾病的機(jī)理研究與防治都有重要作用。在斑馬魚的研究中注射dsRNA更可引起非特異性致死應(yīng)答反應(yīng)，但注射siRNA可減輕這種非特異性應(yīng)答。Hou等使用RNAi技術(shù)比較凡納濱對蝦Toll信號通路和IMD信號通路對抗菌肽不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，發(fā)現(xiàn)RNAi試劑作用在Toll信號通路中可引起較高死亡率，說明2個(gè)免疫通路對細(xì)菌感染有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)2個(gè)免疫通路相互依存[38]。Posiri等對黃頭病毒感染蝦的研究中，發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA PmCHC沉默在內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要功能的PmCHC基因可抑制YHV復(fù)制以及延遲蝦感染死亡時(shí)間[39]。endprint

3.3基因編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)是在基因組水平上對特定位點(diǎn)DNA序列進(jìn)行突變、插入或缺失等改造的遺傳操作技術(shù)，基因編輯不同于RNAi引起基因的“上調(diào)”或“下調(diào)”，是對基因組的永久改變。目前，測序技術(shù)和算法工具日新月異，但無論模式或非模式生物基因組編輯技術(shù)的研究仍然相對滯后，并且還存在諸多局限。基因組編輯是基于DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）和機(jī)體的修復(fù)機(jī)制所產(chǎn)生的新技術(shù)。其中，修復(fù)機(jī)制主要包括：（1）非同源重組末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)；（2）同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)；（3）單鏈退火（single strand annealing，SSA）修復(fù)。制造DSB過程中，天然切割核酸酶識別序列單一、難改變靶標(biāo)，現(xiàn)常使用人工核酸內(nèi)切酶（engineered endonuclease，EEN）：鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子式核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[40-42]、歸巢核酸內(nèi)切酶和RNA靶向編輯技術(shù)成簇間隔的短回文重復(fù)序列系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR-associated genes；CRISPR/Cas）[41]等。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過將入侵病毒或外源DNA片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性；是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種特異性免疫保護(hù)機(jī)制，可抵抗入侵的病毒及外源DNA[43]。在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ、Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要1種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件[44-45]。由于PAM（proto-spacer adjacent motifs）序列結(jié)構(gòu)（5′-NGG-3′）簡單，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點(diǎn)，如今CRISPR/Cas技術(shù)在可編輯位置、拓展性和操作等方面都表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢，但CRISPR/Cas的特異性不高，靶向識別序列存在1個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配依然能被剪切，所以現(xiàn)在面臨的最大問題是脫靶效應(yīng)（off-target effect）即基因組中非目標(biāo)位置產(chǎn)生非必要的DNA突變[44，46]。解決這一問題可根據(jù)基因組數(shù)據(jù)改變sgRNA的設(shè)計(jì)策略，提高Cas9核酸酶特異性如雙切口酶法，Mali等開發(fā)的DB-PACE方法可大大提高核酸酶的DNA結(jié)合能力和切割特異性[47]；Zhang等確定了金黃色葡萄球菌Cas9復(fù)合物（SaCas9）的晶體結(jié)構(gòu)，還證實(shí)該酶的高效DNA切割和精確的DNA靶向[48]。

斑馬魚具有飼育容易、胚胎透明、體外受精、突變種多、遺傳學(xué)工具成熟等諸多優(yōu)點(diǎn)，是研究基因編輯的模式動(dòng)物[2]。Zu等應(yīng)用斑馬魚研究同源重組中的TALEN精確突變[49]；Lundgren等對CRISPR在斑馬魚中的編輯研究進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步研究CRISPR系統(tǒng)提供參考[50]。

4展望

每個(gè)全基因組序列的完成就意味著基因多樣性的完善和對這一物種基因組進(jìn)行開發(fā)利用的開端，基因研究的基本任務(wù)是研究、編輯和利用目的基因，即開發(fā)人們需要有優(yōu)良性狀的基因產(chǎn)物，尤其致病基因在臨床醫(yī)藥應(yīng)用具有很高的開發(fā)價(jià)值，面對尚不清楚功能的基因，隨著研究的深入，也可能成為具有高開發(fā)價(jià)值的功能基因?；谝褱y得的水產(chǎn)動(dòng)物全基因組序列圖譜，結(jié)合比較基因組學(xué)研究方法，通過RNAi和基因編輯驗(yàn)證、改善基因功能，對基因組進(jìn)行深度解析，了解水產(chǎn)動(dòng)物基因組結(jié)構(gòu)和功能特征，極大地推動(dòng)研究者對水產(chǎn)動(dòng)物基因組的有效開發(fā)和深度利用，從而批量發(fā)掘生長、生殖、抗逆等重要性狀相關(guān)功能的基因，研究其作用機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確基因型與表型關(guān)聯(lián)性，為深入開展水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種工作提供基因資源。研究分子設(shè)計(jì)育種的理論和方法，分析基因、系統(tǒng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對環(huán)境的反應(yīng)，開發(fā)生長、發(fā)育、抗性等技術(shù)平臺，為性狀改良和品種培育提供理論基礎(chǔ)。開發(fā)編碼具有特殊營養(yǎng)或應(yīng)用價(jià)值的多肽和蛋白基因，篩選水產(chǎn)動(dòng)物特有的藥物功能基因或藥物合成相關(guān)的功能基因。同時(shí)，各種技術(shù)也需要協(xié)作使用，如：NimbleGen序列捕獲芯片與454測序技術(shù)相結(jié)合可以檢測完整的人類外顯子組[52]，微陣列分析和RNAi技術(shù)相結(jié)合可提高靶定基因過程的特異性和效率等。基因表達(dá)譜、同位素標(biāo)記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和糖微陣列技術(shù)等多種組學(xué)技術(shù)綜合應(yīng)用開發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物的生命資源也是必然趨勢。

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