HPLC法測定重樓塊根中4種重樓皂苷含量研究

韓 平，阮成江，王海明，杜 維，丁 健，張莞晨

(大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室 資源植物研究所，遼寧 大連 116605)

重樓(ParispolyphyllaSmith var.)為百合科植物，其根莖可入藥，有清熱解毒、消腫止痛、止血、涼肝定驚之功效，對治療癌癥、跌打損傷等有顯著療效[1-2]。重樓是云南白藥、宮血寧等藥的主要組成藥物，其主要的有效成分為甾體類皂苷，存在于多種重樓屬藥材中，在生物學(xué)功能的研究中發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的生理和藥理活性。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ為重樓藥材中最主要甾體類皂苷生物活性成分，現(xiàn)有研究已表明其生理和藥理活性明顯，可大規(guī)模應(yīng)用于各種藥品制備[3-5]。目前，重樓藥材中的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量已經(jīng)成為了重樓藥材質(zhì)量控制的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，建立其含量檢測的有效方法具有非常重要的意義[6-8]。

本研究以中藥材重樓為原料，優(yōu)化建立了高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)檢測超聲乙醇法提取的重樓塊根中主要有效活性成分重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ含量的方法，為開發(fā)重樓保健藥品、食品等提供理論依據(jù)和參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重樓購自遼寧省大連市開發(fā)區(qū)藥店,4種重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，乙醇和乙腈溶液均為HPLC色譜純，水為超純水。高效液相色譜型號為Flexar FX-15(美國PE公司)，超聲儀型號為SB-52000(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)。

1.2 色譜條件

Validated C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)。梯度洗脫過程為：0～3 min，10%乙腈；3～38 min，60%乙腈；38～43 min，60%乙腈；43.1 min，10%乙腈；43.1～45.0 min，10%乙腈。流速為0.8 mL·min-1，檢測波長為208 nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為28 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的制備

(1)混合對照品溶液的制備

精確稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的對照品，放置于10 mL容量瓶中，然后加入乙醇溶液定容，配制成質(zhì)量濃度分別為重樓皂苷Ⅰ0.540 mg·mL-1，重樓皂苷Ⅱ0.434 mg·mL-1，重樓皂苷Ⅵ 0.126 mg·mL-1，重樓皂苷Ⅶ 0.103 mg·mL-1的混合對照品溶液，混勻，置于4 ℃冰箱保存待用。

(2)供試品溶液的制備

將烘干后的重樓塊根制成粉末，精確稱取該粉末5份，每份0.500 0 g，置于密封瓶中，精確量取乙醇溶液25 mL加入到瓶中，用電子天平稱定其初始質(zhì)量并記錄，然后用超聲儀(200 W，40 kHz) 超聲提取40 min，冷卻至室溫后再次稱其最終重量，用乙醇溶液補(bǔ)足失重，混勻后，過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜得到供試品溶液，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 線性關(guān)系考察

精確量取混合對照品溶液0.1、0.25、0.5、0.75和1.0 mL，加入乙醇溶液定容至1 mL，混勻后注入高效液相色譜儀，根據(jù)上述色譜條件，對其進(jìn)行檢測分析并記錄色譜峰的峰面積。以重樓皂苷的濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，擬合回歸方程和線性范圍見表1。

表1 重樓中4種重樓皂苷的回歸方程和線性范圍

1.3.3 精密度試驗

精確量取同一質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，根據(jù)上述色譜條件，對其進(jìn)行HPLC測定分析，將該樣品重復(fù)測定5次，記錄峰面積，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)。

1.3.4 重復(fù)性試驗

分別精確量取5份供試品溶液，每份1 mL，根據(jù)上述色譜條件，對其進(jìn)行HPLC測定分析，記錄其色譜圖的峰面積，帶入回歸方程記算出重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗

精確量取1份供試品溶液1 mL，分別在0、2、4、8、16、24和48 h時進(jìn)行HPLC測定分析，記錄色譜圖的峰面積， 計算峰面積的RSD。

1.3.6加樣回收率試驗

精確量取5份供試品溶液，每份1 mL，分別精確加入混合對照品溶液(重樓皂苷Ⅰ1.024 0 mg·mL-1，重樓皂苷Ⅱ0.316 0 mg·mL-1，重樓皂苷Ⅵ 0.037 2 mg·mL-1和重樓皂苷Ⅶ0.070 6 mg·mL-1) 5 mL，配制得到供試品溶液，根據(jù)1.2色譜條件，對其進(jìn)行HPLC測定分析，記錄色譜圖的峰面積。

2 結(jié)果與分析

精密度試驗結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的峰面積RSD分別為1.87%、1.71%、1.90%和1.25%(n=5)，RSD值均小于2%，表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗結(jié)果得到它們的平均含量分別為22.65、6.825、0.803 0和0.882 0 mg·g-1，所對應(yīng)的RSD分別為1.37%、1.29%、1.91%和1.02%，RSD值均小于3%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，峰面積的RSD分別為1.48%、1.86%、1.37%和2.05%(n=5)，RSD值均小于2%，表明重樓樣品的供試品溶液在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

加樣回收率試驗結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ的平均回收率為99.12%，RSD為1.95%；重樓皂苷Ⅱ的平均回收率99.10%，RSD為1.89%；重樓皂苷Ⅵ的平均回收率99.46%，RSD為2.01%；重樓皂苷Ⅶ的平均回收率為96.52%，RSD為2.25%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

精確量取供試品溶液3份，每份1 mL，依據(jù)1.2色譜條件進(jìn)行測定，色譜圖如圖1。記錄色譜圖的峰面積，代入回歸方程計算出樣品中不同重樓皂苷的含量。結(jié)果得到，重樓皂苷Ⅰ含量的平均值為22.50 mg·g-1，重樓皂苷Ⅱ含量的平均值為6.915 mg·g-1，重樓皂苷Ⅵ含量的平均值為0.778 0 mg·g-1，重樓皂苷Ⅶ含量的平均值為0.876 0 mg·g-1。

注:1.重樓皂苷Ⅶ;2.重樓皂苷Ⅵ;3.重樓皂苷Ⅱ; 4.重樓皂苷Ⅰ

3 結(jié) 論

HPLC法具有較高的檢測靈敏度，在檢測分析中藥材活性成分時可提供準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，且操作簡便。本研究建立了利用HPLC法測定中藥材重樓塊根中4種重樓皂苷含量的方法，可為中藥材重樓塊根中的4種皂苷含量的定性定量分析提供科學(xué)方法，在中藥材重樓的藥用成分分析和開發(fā)利用方面具有重要意義。

本研究通過改進(jìn)優(yōu)化付紹智等[7]研究中HPLC檢測的色譜條件70 min，20%～100%乙腈梯度洗脫，結(jié)果顯示4種重樓皂苷在色譜柱中分離效果更佳。采用超聲乙醇提取方法，利用HPLC測定的重樓塊根中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量與羅延順等[8]采用加熱回流乙醇提取方法測定的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ含量(26.54、6.658、1.303和1.256 mg·g-1)的研究結(jié)果相差不大，但考慮到實驗的操作過程，超聲法的操作更簡便。因而，超聲乙醇提取法是HPLC測定重樓塊根中4種主要重樓皂苷含量的有效方法。

[1] 劉佳,張鵬,宋發(fā)軍, 等.重樓地上部分四種重樓皂苷含量的分析[J].時珍國醫(yī)國藥, 2015,13(5):1233-1235.

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[7] 付紹智, 李楠, 劉振, 等. HPLC法測定不同產(chǎn)地重樓屬植物中7種甾體皂苷成分[J]. 中草藥, 2012, 36(12):2435-2437.

[8] 羅延順,胡建勇,李楊, 等.HPLC法測定重樓種植藥材中4種重樓皂苷的含量.中國藥師, 2016, 19(1): 5-7.