水通道蛋白1，3在變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜的表達(dá)及促鼻內(nèi)腺體分泌的研究

許敏達(dá)

變應(yīng)性鼻炎是一種常見的耳鼻喉科疾病，其發(fā)病率高達(dá)30%[1-2],臨床表現(xiàn)為噴嚏、鼻溢、鼻癢等癥狀。目前臨床藥物治療效果欠佳，考慮可能與變應(yīng)性鼻炎發(fā)生機(jī)制尚未闡明有關(guān)[3]。有研究表明，水通道蛋白(AQP)在維持機(jī)體液體轉(zhuǎn)運(yùn)平衡中起著極其重要的作用，而變應(yīng)性鼻炎的高分泌性可能與AQP的表達(dá)異常有關(guān)[4-5]。本研究探討AQP與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系，并分析其在變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜的表達(dá)情況及對(duì)腺體分泌的影響，旨在為變應(yīng)性鼻炎的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔級(jí)健康大鼠40只購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不拘，體重為200～300 g，將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只，動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程均符合西安市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 卵白蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；AQP1,3抗體購(gòu)自美國(guó)PE公司；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；RM2145型切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)LEICA公司，奧林巴斯生物顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器五廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海姚氏儀器設(shè)備廠；HH-600-數(shù)顯三用恒溫水箱購(gòu)自江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型制備:根據(jù)許海波[6]和李欽等[7]的方法進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)組以O(shè)VA經(jīng)全身致敏并進(jìn)行強(qiáng)化致敏，每天以1 mg/ml OVA滴鼻，對(duì)其進(jìn)行激發(fā)，直至建立大鼠變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型。具體操作步驟：將大鼠分組后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。首先全身致敏：采用10%水合氯醛3 ml/kg對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，并于大鼠左右前肢和后肢跖部皮下各一點(diǎn)注射0.2 ml和0.3 ml的抗原佐劑混懸液[每毫升含1 mg OVA，2 mg Al(OH)3]進(jìn)行致敏。初次致敏5 d后開始強(qiáng)化致敏，在大鼠背部皮下10處注射0.5 mg OVA(溶于1 ml生理鹽水)；自初次致敏后第7天起每天用1 mg/ml OVA滴鼻1次(含有OVA溶液均以生理鹽水配制)，每次20 μl，并觀察滴鼻后大鼠打噴嚏、搔鼻的次數(shù)及鼻塞情況，每次觀察30 min，并記錄。模型建立后沿中線打開鼻腔后，以小棉棒輕輕擦取鼻腔黏膜表面的黏液，做涂片后行免疫組化染色。

1.3.2模型制備成功標(biāo)準(zhǔn):連續(xù)觀察3～4周，并進(jìn)行疊加積分評(píng)價(jià)動(dòng)物模型，當(dāng)積分>5分時(shí)表示成功造模[6]。對(duì)搔鼻和噴嚏次數(shù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)分。0分:鼻塞正常,吸氣明顯，鼻翼扇動(dòng)；1分:鼻塞,濕啰音可聽到，且吸氣明顯，鼻翼扇動(dòng)；2分:鼻塞，濕啰音明顯，吸氣明顯，鼻翼扇動(dòng)；3分：鼻塞，濕啰音明顯，且出現(xiàn)次數(shù)較多≥2次。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血清學(xué)檢測(cè)：血清中Ca2+、K+、Na+和Cl-濃度應(yīng)用間接電極的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2免疫組化染色：AQP1,3的檢測(cè)應(yīng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作(兔抗大鼠多克隆抗體)，實(shí)驗(yàn)中AQP的陽(yáng)性對(duì)照用豚鼠腎臟做對(duì)比，陽(yáng)性是腎小管上皮細(xì)胞胞漿中染色為褐色。本實(shí)驗(yàn)利用PBS來(lái)代替一抗作為陰性對(duì)照，采用Image-Pro Plus 6軟件計(jì)算平均光密度值，計(jì)算表達(dá)面積的比值。

1.4.3鼻內(nèi)腺體分泌率檢測(cè)：大鼠麻醉后，在20℃下，用棉線著染段置于一側(cè)鼻中段前下方黏膜處，靜止不動(dòng)，5 min后取下棉線，立即測(cè)量棉線熒光素染色長(zhǎng)度，棉線吸收率為0.054 μl/min，測(cè)得熒光棉線染色長(zhǎng)度(mm)乘以吸收率為鼻內(nèi)腺體分泌量。

2 結(jié)果

2.1血清離子濃度 實(shí)驗(yàn)組血清Ca2+和K+濃度較對(duì)照組降低，Na+濃度較對(duì)照組升高(P<0.01)；兩組血清Cl-濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2AQP1，3表達(dá)情況 兩組大鼠AQP1，3在鼻黏膜中表達(dá)不等，見圖1。對(duì)照組AQP1.3表達(dá)面積為(14.84±1.56)%，實(shí)驗(yàn)組為(21.32±2.43)%。實(shí)驗(yàn)組AQP1,3表達(dá)面積較對(duì)照組增加(P<0.05)。

表1 兩組大鼠血清離子濃度比較

注：對(duì)照組為正常大鼠，實(shí)驗(yàn)組為變應(yīng)性鼻炎模型；與對(duì)照組比較，bP<0.01

圖1兩組大鼠鼻黏膜水通道蛋白1,3表達(dá)情況(SP×200)

A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組

2.3鼻內(nèi)腺體分泌情況 對(duì)照組鼻內(nèi)腺體分泌量為(0.58±0.07)μl/min，實(shí)驗(yàn)組為(2.07±0.36)μl/min。實(shí)驗(yàn)組鼻內(nèi)腺體分泌量高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

變應(yīng)性鼻炎模型的建立基本上都分為致敏階段和激發(fā)階段，但是對(duì)于模型建立過(guò)程中的細(xì)節(jié)，不同的研究單位和實(shí)驗(yàn)室有著不同的建模方案，本實(shí)驗(yàn)以O(shè)VA經(jīng)全身致敏，強(qiáng)化致敏后，以1 mg/ml OVA每天滴鼻，進(jìn)行激發(fā)，直至建立大鼠變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型。

鼻黏膜受體可以與醛固酮發(fā)生結(jié)合作用，這種結(jié)合作用有效地降低內(nèi)淋巴液中K+濃度,增加Na+濃度，以及由此通過(guò)K+濃度改變內(nèi)、外淋巴液滲透壓[7]。因此醛固酮的增加可上調(diào)大鼠鼻黏膜AQP1,3的表達(dá)水平，并與其結(jié)合，AQP1,3表達(dá)的增加可能會(huì)直接改變水在鼻內(nèi)的分布狀態(tài)，誘導(dǎo)水代謝失調(diào)，進(jìn)而發(fā)生變應(yīng)性鼻炎。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組血清Ca2+和K+濃度低于對(duì)照組，Na+濃度高于對(duì)照組，提示變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生和AQP1,3的表達(dá)增加可能與機(jī)體醛固酮水平改變有關(guān)。

AQP1,3在不同組織表達(dá)部位的水平不同。有研究報(bào)道，AQP1,3在眼部的表達(dá)豐富：睫狀體非色素上皮、小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、晶狀體均有表達(dá)[8]。Stamer等[9]研究顯示，AQP1,3可能參與眼房水形成，青光眼的發(fā)病可能與其表達(dá)失衡有關(guān)。AQP1,3也表達(dá)于腦脈絡(luò)膜上皮微絨毛細(xì)胞頂質(zhì)膜，參與了水液由血液進(jìn)入腦脊液的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，而且對(duì)大腦急性損傷時(shí)導(dǎo)致腦水腫的形成有重要作用[10]。AQP1,3在大鼠和人近端小管和髓袢降支上皮細(xì)胞的頂端和基底外側(cè)膜均有表達(dá)[11-12]，并參與腎臟水液的重吸收，以及對(duì)滲透梯度的形成有重要作用。然而，AQP1,3并未在大鼠鼻咽或鼻甲表層上皮檢測(cè)到，但在鼻咽上皮下毛細(xì)血管和小靜脈及鼻甲中毛細(xì)血管和靜脈竇表達(dá)水平較高[13]。AQP1,3在肝膽管內(nèi)皮細(xì)胞基底外側(cè)膜上及尿路上皮、鼻息肉中也有表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP1,3在鼻黏膜上皮下成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)豐富；而在上皮細(xì)胞層、黏膜內(nèi)腺體及導(dǎo)管均未見AQP1,3抗體標(biāo)記，且實(shí)驗(yàn)組AQP1,3表達(dá)水平高于對(duì)照組。提示AQP1,3的增加可能會(huì)誘導(dǎo)了內(nèi)淋巴的生成增多，導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生。 與江一鳴等[13]研究結(jié)果一致。

變應(yīng)性鼻炎時(shí)，經(jīng)變應(yīng)原激發(fā)毛細(xì)血管通透性增加，腺體分泌增強(qiáng)是大量鼻涕產(chǎn)生的主要液體來(lái)源。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組鼻內(nèi)腺體分泌量高于對(duì)照組。提示AQP1,3的增加可能會(huì)誘導(dǎo)鼻內(nèi)腺體活性增強(qiáng)，使其腺體分泌增加。 依據(jù)AQPs分布部位，AQP1,3表達(dá)增強(qiáng)，有利于上皮下組織液通過(guò)上皮層細(xì)胞，以及利于液體經(jīng)腺細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至腺管，促進(jìn)大量鼻涕的產(chǎn)生，提示膜迷路積水的發(fā)生可能是由于AQP1,3表達(dá)增加誘導(dǎo)了內(nèi)淋巴產(chǎn)生增多導(dǎo)致的，但其發(fā)病機(jī)制仍需要進(jìn)一步探明。

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