miR-26a與EZH2蛋白的關系及其對肺癌細胞的增殖和凋亡行為的影響

高 陽，陳 紅

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，總體生存率約15%[1]。肺癌早期診斷取決于胸部X線和痰細胞學檢查[2]，但是往往患者在確診時病情已發(fā)生進展，所以需要明確肺癌的發(fā)病機制，了解其分子生物學的變化。近年，miRNA作為一類極具潛力的分子生物標記物得到了越來越多學者的認可[3]，其在肺癌發(fā)病機制中起到關鍵作用，且其表達變化也與肺癌的狀態(tài)息息相關[4]。有研究報道，組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)由人類EZH2基因所編碼，起到細胞調(diào)節(jié)作用，其高表達能促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[5]。本研究探討miR-26a與EZH2在肺癌中的表達情況及其對細胞生物學行為的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1組織樣品和細胞培養(yǎng) 收集2016年8月—2017年1月在四川省人民醫(yī)院行手術(shù)切除肺癌腫瘤組織和癌旁正常組織21例，病理類型均為非小細胞肺癌，經(jīng)組織病理學證實。其中男14例，女7例，年齡43～69歲，中位年齡58歲。所有患者術(shù)前均未接受放化療。本研究通過醫(yī)院的醫(yī)學倫理委員會的同意。切除的腫瘤組織和正常組織樣本立即放入液氮中冷凍并儲存在-80℃直至RNA提取。按照Trizol說明書提取組織中總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度，復能基因有限公司設計miR-26a引物，使用U6作為內(nèi)參，以100 ng總RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min。根據(jù)試劑盒說明書進行聚合酶鏈反應(PCR)。

1.2細胞株和實驗試劑 人非小細胞肺癌細胞株A549由上海細胞生物研究所提供。RPMI-1640培養(yǎng)液、10%新生小牛血清、含100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的0.25%胰酶溶液購自Gibco公司,二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。細胞在含有10% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%左右濃度時進行傳代和凍存，用于后續(xù)的實驗。細胞培養(yǎng)瓶和24、96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、miR-26a mimics/inhibitor購自上海吉凱基因，Trizol購自美國Ambion公司，EZH2抗體購于美國abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購自美國Kapa公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成。

1.3PCR miR-26a mimics和inhibitor購自GenePharma(中國上海)。將200 μl含有100 pmol miR-26a mimics的無血清、無抗生素的培養(yǎng)基與5 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)溶解在200 μl相同培養(yǎng)基混合，并使其靜置20 min。然后將所得的400 μl轉(zhuǎn)染溶液加入含有1.6 ml培養(yǎng)基的每個孔中。6 h后，用補充有10% FBS和抗生素的2 ml新鮮培養(yǎng)基代替培養(yǎng)物。同樣方法處理miR-26a inhibitor和miR-26a control(對照組)。使用Trizol試劑分離非小細胞肺癌細胞株的總RNA，并使用TM miRNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)進一步純化miRNA部分。通過光譜測定RNA樣品的濃度和純度。使用實時PCR系統(tǒng)進行實時逆轉(zhuǎn)錄PCR(qPCR)。U6管家基因作為對照。反應條件：95℃ 10 min，45個循環(huán)；在95℃變性10 s，在60℃下退火和延伸60 s。使用2-ΔΔCt方法計算非小細胞肺癌細胞株的miRNA相對表達量。實驗重復3次。本研究中使用的引物如下：miR-26a上游引物，5'-GTGGTTTCAACTTATATTATAAGAACG-3'，下游引物,5'-GACGAAAAGACGTCAAAACTCATTT-3';U6內(nèi)參上游引物,5'-AGAAAATCTGCGCTTGGTCGTCC-3'，下游引物,5'-TAGCCGTGATATCGATGTAGCAA-3'。

1.4蛋白免疫印跡檢測EZH2蛋白表達水平 細胞用冰冷的PBS洗滌，然后用蛋白質(zhì)裂解物(Pierce，Rockford，IL，USA)裂解。在4℃下以5000×g離心15 min后，用二亞鉻酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。按照說明書配制10% SDS-PAGE分離膠，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST充分沖洗后，使用1∶1000稀釋一抗孵育(兔單克隆HTN1抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記羊抗兔IgG(1∶2500)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實驗重復3次。

1.5雙熒光素酶實驗驗證miR-26a和EZH2的關系 將24孔板中的miR-26a或NC細胞與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎螢光素酶的pRL-TK對照載體共轉(zhuǎn)染，根據(jù)siPORTneoFX使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染24 h后測定熒光素酶活性。對于每個轉(zhuǎn)染的螢火蟲螢光素酶活性被檢測為海腎螢光素酶活性。實驗重復3次。miR-26a上游引物，5'-GTGGTTTCAACTTATATTATAAGAACG-3'，下游引物,5'-GACGAAAAGACGTCAAAACTCATTT-3';EZH2克隆的引物如下：上游引物，5'-CGGGGTACCGAGTCATACTTGTGAAG-3'；下游引物，3'-GCACTCGAGCCTGTTTTTGTTTGATG-5'。

1.6甲基噻唑基四唑(MTT)實驗測定細胞增殖情況 將對數(shù)期生長的A549細胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以1×103個/孔的密度接種到96孔板中。在細胞培養(yǎng)7 d后，加入20 μl MTT測定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24、48、72、96 h進行MTT測定波長為490 nm時的吸光度，計算A549細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.7細胞凋亡實驗 使用Annexin V-Fluos染色試劑盒檢測細胞凋亡。細胞用PBS洗滌，并根據(jù)說明書染色。將載玻片與Permafluor安裝介質(zhì)一起安裝，并在熒光顯微鏡(Axiophot; Olympus，Tokyo，Japan)下觀察。

2 結(jié)果

2.1miR-26a在肺癌組織中的表達 癌旁正常組織miR-26a表達水平為1.89±0.31，肺癌組織為0.26±0.12。肺癌組織miR-26a表達水平低于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2miR-26a 表達量的檢測 miR-26a mimics組中miR-26a相對表達量為5.49±0.81，miR-26a inhibitor組為0.43±0.22，對照組為1.26±0.42。miR-26a mimics組miR-26a相對表達量高于對照組，miR-26a inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.3miR-26a對A549細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染72 h和96 h時，miR-26a inhibitor組A549細胞增殖活性高于對照組(P<0.05)；在96 h時，miR-26a mimics組增殖活性低于對照組(P<0.05)；24、48 h 3組A549細胞增殖情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組A549細胞增殖情況

注：與對照組比較，aP<0.05

2.4miR-26a對A549細胞凋亡的影響 miR-26a mimics組A549細胞凋亡率為(31.06±4.57)%，miR-26a inhibitor組為(8.15±2.03)%，對照組為(19.54±3.98)%。miR-26a mimics組A549細胞凋亡率高于對照組，miR-26a inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.5miR-26a靶向調(diào)控EZH2的表達 雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-26a mimics后可明顯抑制EZH2熒光素酶活性。miR-26a mimics組、miR-26a inhibitor組和對照組EZH2蛋白相對表達量分別為0.64±0.09、1.73±0.04和1.05±0.04。miR-26a mimics組EZH2蛋白相對表達量低于對照組，而miR-26a inhibitor組蛋白表達量高于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-26a對3組EZH2蛋白表達的影響

3 討論

腫瘤發(fā)生是由遺傳損傷和表觀遺傳變化所引起的生物學過程[6]，尋找腫瘤差異基因和鑒定新型腫瘤相關基因是研究治療的重點[7]。miRNA是一類高度保守的短非編碼RNA，其通過與3'UTR區(qū)域不完全堿基配對，起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶mRNA表達作用[8]。最近，有學者通過腫瘤組織、腫瘤細胞株與正常組織比較，闡明了癌癥與miRNA的關系[9]。不同類型惡性腫瘤miRNA的表達也有一定差異[10]，且miRNA與腫瘤之間的關系還表現(xiàn)在某些miRNA基因在腫瘤中的擴增和缺失[11-12]。據(jù)報道，抑制或上調(diào)某些關鍵的miRNA，能促進腫瘤細胞在體內(nèi)或體外的生物學行為的改變[13]。因此，miRNA可以作為抑制腫瘤的分子靶點。如在肺癌中，miR-let7、miR-155、miR-29和miR-31已被報道為可以作為腫瘤抑制因子或抑癌基因[14-15]。miR-26a在甲狀腺癌、淋巴瘤、橫紋肌肉瘤中表現(xiàn)出一定程度的上調(diào)[16-17]，但是其在肺癌中的作用卻鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-26a 的表達水平低于癌癥正常組織，miR-26a mimics組miR-26a表達量高于對照組，miR-26a inhibitor 組低于對照組，提示miR-26a與肺癌有較高的相關性，其表達降低與腫瘤生成有關，同時還影響了肺癌細胞的增殖和凋亡，所以其可能起到了一定的抑癌作用。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與調(diào)節(jié)各種生物發(fā)展過程，包括發(fā)育、細胞增殖和細胞分化[18-19]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72、96 h miR-26a inhibitor 組A549細胞增殖活性高于對照組，96 h miR-26a mimics組低于對照組，miR-26a mimics組細胞凋亡率高于對照組，miR-26a inhibitor 組低于對照組，提示miR-26a可調(diào)控肺癌A549細胞的增殖和凋亡。

miRNA與轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡有密切聯(lián)系，抑制基因表達，減少腫瘤相關蛋白的生成，以達到抑制腫瘤的作用。EZH2能誘導E-鈣黏蛋白沉默，并影響其他靶基因，調(diào)控腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[20]。EZH2已經(jīng)在乳腺癌和前列腺癌中被證實與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移能力密切相關，且參與了肺癌的進展[21-22]。Breuer等[23]發(fā)現(xiàn)EZH2 PcG致癌基因在支氣管肺癌中異常表達，且EZH2表達的改變要早于肺癌細胞的增殖。Kikuchi等[24]證實EZH2高表達與腫瘤侵襲性相關，其可能為非小細胞肺癌新的預后標記。Yoon等[25]研究表明EZH2的突變體與肺癌風險降低有關，提出了其可能成為肺癌易感性的標志物。本研究結(jié)果顯示，miR-26a mimics 組EZH2蛋白相對表達量低于對照組，miR-26a inhibitor 組蛋白表達量高于對照組。

綜上所述，miR-26a表達的降低與腫瘤的生成有關，同時其能抑制肺癌細胞增殖和誘導細胞凋亡，與EZH2的3'UTR特異性結(jié)合，并可抑制EZH2蛋白的表達活性。miR-26a在肺癌分子病因?qū)W中起到重要作用，可成為治療肺癌的新靶點。

[1] Siegel R L, Miller K D, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J].CA cancer J Clin, 2016,66(1):7-30.

[2] Moyer V A. Screening for lung cancer: US Preventive Services Task Force recommendation statement[J].Annals of internal medicine, 2014,160(5):330-338.

[3] Lin S, Gregory R I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer[J].Nat Rev Cancer, 2015,15(6):321-333.

[4] Kasinski A L, Kelnar K, Stahlhut C,etal. A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J].Oncogene, 2015,34(27):3547-3555.

[5] Kim K H, Roberts C W. Targeting EZH2 in cancer[J].Nat Med, 2016,22(2):128-134.

[6] 趙欣,李媛媛,曹丁丁,等.腫瘤表觀基因組學研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2016,16(1):172-175.

[7] 鄧洪新,魏于全.腫瘤基因治療的研究現(xiàn)狀和展望[J].中國腫瘤生物治療雜志,2015，22(2):170-176.

[8] Ha M， Kim V N. Regulation of microRNA biogenesis[J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2014,15(8):509-524.

[9] Hayes J, Peruzzi P P, Lawler S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy[J].Trends Mol Med, 2014,20(8):460-469.

[10] Di Leva G, Garofalo M, Croce C M. MicroRNAs in cancer[J].Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 2014,9:287-314.

[11] Chen S, Xue Y, Wu X,etal. Global microRNA depletion suppresses tumor angiogenesis[J].Genes development, 2014,28(10):1054-1067.

[12] Adams B D, Kasinski A L, Slack F J. Aberrant regulation and function of microRNAs in cancer[J].Curr Biol, 2014,24(16):R762-776.

[13] Acunzo M, Romano G, Wernicke D,etal. MicroRNA and cancer--a brief overview[J].Adv Biol Regul, 2015,57:1-9.

[14] Ding S, Xu Y, Shen L,etal. MiR-155 promotes proliferation of human non-small cell lung cancer H460 cells via targeting TP53INP1[J].Int J Clin Exp Med, 2017,10(8):11953-11960.

[15] Xu H, Ma J, Zheng J,etal. MiR-31 Functions as a Tumor Suppressor in Lung Adenocarcinoma Mainly by Targeting HuR[J].Clin Lab, 2016,62(4):711-718.

[16] Ren G, Li H, He X,etal. Downregulation of serum miR-26a predicts poor clinical outcome of papillary thyroid carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol, 2017,10(8):9042-9047.

[17] Zhao X, Lwin T, Zhang X,etal. Disruption of the MYC-miRNA-EZH2 loop to suppress aggressive B-cell lymphoma survival and clonogenicity[J].Leukemia, 2013,27(12):2341-2350.

[18] Cheng C J, Bahal R, Babar I A,etal. MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumor microenvironment[J].Nature, 2015,518(7537):107.

[19] Farmer D T, McManus M T. MicroRNAs in ectodermal appendages[J].Curr Opin Genet Dev, 2017,43:61-66.

[20] Liu L, Xu Z, Zhong L,etal. Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) promotes tumour cell migration and invasion via epigenetic repression of E-cadherin in renal cell carcinoma[J].BJU international, 2016,117(2):351-362.

[21] Wu C, Jin X, Yang J,etal. Inhibition of EZH2 by chemo-and radiotherapy agents and small molecule inhibitors induces cell death in castration-resistant prostate cancer[J].Oncotarget, 2016,7(3):3440-3452.

[22] Riquelme E, Behrens C, Lin H Y,etal. Modulation of EZH2 expression by MEK-ERK or PI3K-AKT signaling in lung Cancer is dictated by different KRAS oncogene mutations[J].Cancer Res, 2016,76(3):675-685.

[23] Breuer R H, Snijders P J, Smit E F,etal. Increased expression of the EZH2 polycomb group gene in BMI-1-positive neoplastic cells during bronchial carcinogenesis[J].Neoplasia, 2004,6(6):736-743.

[24] Kikuchi J, Kinoshita I, Shimizu Y,etal. Distinctive expression of the polycomb group proteins BMI1 polycomb ring finger oncogene and enhancer of zeste homolog 2 in nonsmall cell lung cancers and their clinical and clinicopathologic significance[J].Cancer, 2010,116(12):3015-3024.

[25] Yoon K A, Gil H J, Han J,etal. Genetic polymorphisms in the polycomb group gene EZH2 and the risk of lung cancer[J].J Thorac Oncol, 2010,5(1):10-16.