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    淺談“5M1E”分析法在NGS實驗室管理中的應(yīng)用

    2018-02-05 20:36:28潘石玄偉
    浙江化工 2018年11期
    關(guān)鍵詞:試劑測序實驗室

    潘石玄偉

    (杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司,浙江 杭州 310018)

    隨著高通量測序技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的突飛猛進,正在對傳統(tǒng)的醫(yī)學檢驗產(chǎn)生影響,高通量測序技術(shù)已在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、染色體拷貝數(shù)變異篩查、遺傳病致病位點篩查、胚胎植入前診斷等臨床檢驗中心應(yīng)用。最近隨著國家食品藥品監(jiān)督管理局連續(xù)批準基于高通量測序技術(shù)(NGS)以及伴隨診斷標準審批的多基因腫瘤突變聯(lián)合檢測試劑盒,高通量測序技術(shù)將會拓展到腫瘤領(lǐng)域精準醫(yī)療。

    高通量測序技術(shù)不管是采用一站式的解決方案還是共建實驗室的形式,只有檢測結(jié)果質(zhì)量的可靠,臨床應(yīng)用才能落到實處。如何保證檢測結(jié)果的準確性?NGS實驗室管理迫切需要科學化、規(guī)范化、標準化及國際化,那么“5M1E”分析法如何在NGS實驗室管理中得以運用呢?

    5M1E其實就是對全面質(zhì)量管理理論中六個影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素的簡稱,是指6種分析維度與方法,其中五項的英文是以M開頭,一項是 E 開頭的,分別為:5M:Man(人),Machine(機),Material(料),Method(法),Measure(測);1E:Environment(環(huán))。

    1 Man(人)

    人員是NGS實驗室管理中最活躍的因素,對實驗室的全部活動起著主導(dǎo)和支配作用,是決定實驗室檢測質(zhì)量的根本因素。

    1.1 專業(yè)與能力

    二代測序?qū)嶒灢僮鞯膹?fù)雜,對NGS檢驗人員不能僅僅停留在簡單進行儀器操作這個層面上。為保證檢驗結(jié)果的快速、準確,不但要熟練掌握各種儀器的操作,更要了解可能影響檢驗結(jié)果的全方位因素,檢驗人員在技能方面必須有分子生物的專業(yè)知識和技術(shù)能力。

    1.2 教育與培訓

    人員的培訓在保證檢驗質(zhì)量中尤為重要,從事二代測序的檢驗人員在上崗前必須先進行臨檢中心《臨床基因擴增實驗室技術(shù)人員培訓合格證》和NGS技術(shù)的理論與技能培訓。分析人員需要經(jīng)過生物信息學的培訓。

    1.3 專才到全才

    為了讓檢驗人員可以保證質(zhì)量的前提下快速上崗,可以將NGS實驗室崗位細分,如收樣、提取、建庫、質(zhì)檢純化、上機測序等,先按單崗進行培訓考核上崗,定崗定區(qū)域,等熟練后再進行全方位培訓,這樣有助于實驗室人員的安排,也有助于檢測結(jié)果的準確性。

    2 Machine(機)

    機是指直接或間接用于檢測分析的對檢測結(jié)果有影響的儀器設(shè)備及有關(guān)輔助性儀器設(shè)備等,這里包含了測序后數(shù)據(jù)分析軟件。

    2.1 儀器設(shè)備的校準與確認

    對于檢測設(shè)備,經(jīng)過采購、到貨驗收、安裝調(diào)試等過程后,首先在設(shè)備投入使用前進行校準或驗證確認,確保用于檢測的設(shè)備及其軟件達到檢測的準確度和規(guī)范性。當校準報告給出一組修正因子時,需要將其校準因子在實際中得以正確運用,否則會有儀器偏差引入。

    2.2 數(shù)據(jù)分析軟件

    這是NGS實驗室特有的環(huán)節(jié),實驗室需要用商品試劑配套的軟件進行數(shù)據(jù)分析,確認使用軟件的版本和數(shù)據(jù)庫的現(xiàn)行有效版本;數(shù)據(jù)需要專業(yè)的生物信息學人員進行分析,需要在數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)比對、數(shù)據(jù)質(zhì)控、分析判斷等每個流程進行質(zhì)控,確保數(shù)據(jù)分析的準確性。

    2.3 儀器的配套使用

    需要使用商品試劑申報時的配套儀器的型號,如廣州燃石醫(yī)學檢驗所有限公司人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突變聯(lián)合檢測試劑盒 (可逆末端終止測序法)受理號為CSZ1700157,配套的型號為Illumin公司生產(chǎn)MiSeqDx,雖然Illumina公司有 MiSeq、MiniSeq、NextSeq500 等不同型號的測序儀,而在檢測過程中必須采用MiSeqDx型號的儀器,否則會帶來儀器之間的差異,影響檢測結(jié)果的準確性。

    2.4 設(shè)備的標識

    設(shè)備標識是設(shè)備管理過程中非常重要的一個環(huán)節(jié),設(shè)備要有一個唯一性編號的標識,這個編號是唯一性的,雖然是同樣型號的也不允許重復(fù),只有這樣才能做到檢測數(shù)據(jù)的溯源性要求。還有設(shè)備的運行、維修、暫停等狀態(tài),防止設(shè)備的非預(yù)期使用影響到檢測結(jié)果。

    2.5 設(shè)備的維護和保養(yǎng)

    設(shè)備要定期做好維護和保養(yǎng),一般校準和驗證的周期為1年,中間可以采用標準物質(zhì)或同型號設(shè)備間進行比對,確保設(shè)備的性能,保證結(jié)果的準確性。如設(shè)備有大的關(guān)鍵零件的維修更換、精密儀器的搬動位置等,需要對設(shè)備的性能重新進行驗證確認。如測序儀等設(shè)備對外界環(huán)境有溫濕度要求的,要確保環(huán)境要求符合要求并做好監(jiān)控好記錄,否則外界環(huán)境對檢測結(jié)果都存在影響。

    3 Material(料)

    不局限于實驗室的試劑和耗材,還包含檢測的樣本,檢測記錄和報告。

    3.1 樣本

    確保NGS檢測結(jié)果的準確性,樣本的質(zhì)量起著關(guān)鍵性的決定作用,實驗室應(yīng)制定正確采集處理原始樣品、標識及樣品的質(zhì)檢標準的文件化程序。

    3.1.1 采集前活動的指導(dǎo)

    如采集的方法、影響采集方法的因素,樣本采集的類型和量、樣本存儲的容器和必需添加物。

    3.1.2 采集活動的指導(dǎo)

    采集患者身份的確認、采集樣本的原始標識,采集時間等。

    3.1.3 樣品的存儲和標識

    樣品存儲溫度的要求、使用的保存液,從樣本開始直到樣品報告出具的在整個實驗室流轉(zhuǎn)過程都具有唯一性標識,防止混淆。除了樣本本身的區(qū)別標識,還應(yīng)該有樣品的狀態(tài)標識,如待檢、檢測中、已檢三種狀態(tài),分別存放在不同的區(qū)域中,做到有效隔離。

    3.1.4 制定樣本的質(zhì)檢標準

    如石蠟包埋 (FFPE)的非小細胞肺癌(NSCLC)組織樣本,腫瘤細胞含量應(yīng)達20%以上,提取的DNA量應(yīng)大于50 ng才能開始NGS的下一步檢測,如樣本質(zhì)檢不合格需要重新進行采樣,如不進行樣本的質(zhì)檢直接進入下一道工序,到最后發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果不符合要求,耽誤患者用藥時間。

    3.2 試劑

    實驗室應(yīng)制定用于試劑的接收、驗收、使用、存儲的文件。試劑到貨時進行外觀及性能的進貨驗收,按照存儲溫度及批號規(guī)則進行試劑的存放,按照批號、效期的原則錄入到系統(tǒng)并做好庫位卡,試劑領(lǐng)用做到先進先出原則。商品化試劑在用于臨床樣本檢測應(yīng)進行有效的性能驗證(如準確性、靈敏度、特異性)。NGS的商品試劑因都是低溫保存,一般都會有開瓶有限期和反復(fù)凍融次數(shù)要求,實驗室在使用過程中需要及時記錄開瓶日期和凍融次數(shù),使用時可根據(jù)需要進行分裝,避免反復(fù)凍融。若分裝后的物料需要繼續(xù)保存,則應(yīng)注明物料名稱、原瓶開瓶日期、分裝日期等信息,確保試劑的可靠性。

    3.3 耗材

    NGS實驗室都會用到各種規(guī)格的移液槍頭、PCR管、離心管等一次性耗材。市場上有眾多的廠家及規(guī)格型號,在NGS實驗過程中應(yīng)確保使用無菌、濾芯、低吸附的規(guī)格型號;同時確保無脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)污染。

    3.4 記錄和報告

    記錄和報告也是一種特殊的物料,記錄設(shè)計要有檢測樣本、使用的設(shè)備編號、使用的試劑批號、檢測日期、檢測人、復(fù)核人、檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)等信息,方便追溯。每個實驗環(huán)節(jié)需要及時、準確、真實填寫各種記錄,定期整理歸檔管理。檢測報告內(nèi)容應(yīng)包括但不局限于患者人員信息、病歷信息、樣本信息、所用試劑和分析軟件信息、檢測結(jié)果及解釋,報告人及有簽發(fā)報告資質(zhì)人員的簽名。報告應(yīng)簡潔扼要、通俗易懂。

    4 Method(法)

    為了使NGS實驗規(guī)范管理,操作標準統(tǒng)一,保證檢測結(jié)果的準確性!需要制定各種程序性文件、作業(yè)指導(dǎo)書、記錄表單,文件保持現(xiàn)行有效版本,方便實驗室人員隨時取閱,做到“有法可依、有法必依、執(zhí)法必嚴、違法必究”。

    4.1 程序性文件

    可以參照CNAS-CL02:2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》的要素建立實驗室管理的質(zhì)量手冊和程序性文件。

    4.2 操作性規(guī)程

    可以采用圖文并茂的方式建立實驗操作細節(jié)、設(shè)備操作規(guī)程、質(zhì)控方法及質(zhì)控標準等。

    4.3 記錄表單

    可以根據(jù)NGS的工序如收樣、提取、建庫、純化、上機測序各工序形成全套的實驗操作記錄;另外配套的各類表單如設(shè)備使用、維護、保養(yǎng)記錄、溫濕度監(jiān)控記錄、試劑的配置記錄等,均需實驗室受控發(fā)放使用。

    5 Environment(環(huán))

    “環(huán)”是指檢測過程中的實驗室硬件環(huán)境。

    5.1 實驗室設(shè)計布局

    NGS實驗室設(shè)置應(yīng)該嚴格分區(qū),申請臨床基因擴增檢驗實驗室驗收,標準化分區(qū)及空氣流向,確保工作有序,互不干擾,防止污染。原則上NGS實驗室應(yīng)當分為試劑儲存和準備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域(第一擴增區(qū))、文庫擴增區(qū)(第二擴增區(qū))、文庫檢測區(qū)、測序區(qū)、電泳區(qū)共八個區(qū),每個房間壓差依次梯度≥5 Pa,設(shè)置PCR專用走廊和緩沖間,在緩沖間內(nèi),可設(shè)置正壓,使室內(nèi)空氣不流向室外,室外空氣不流向室內(nèi)。

    5.2 人流物流管理

    嚴格人流物流分開,嚴格遵守從一區(qū)到八區(qū)的單一方向制度,不得反向進入前一個區(qū),盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染。

    5.3 區(qū)域管理

    在各個實驗區(qū)使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服和物品(如不同顏色),每個工作區(qū)域均有專用的儀器設(shè)備,各區(qū)域儀器設(shè)備須有明確的標記,避免設(shè)備物品如加樣器等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出,當工作人員離開時不得不將本區(qū)的工作服、手套、口罩和物品帶到其他區(qū)域,從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆污染。

    5.4 環(huán)境衛(wèi)生

    每個區(qū)域都應(yīng)該有獨立的清潔工具,每個區(qū)域的清潔工具不得混用,清潔時候從一區(qū)到八區(qū)的單一方向制度,工作結(jié)束后用75%的乙醇擦拭工作臺面,用紫外線燈(建議安裝無臭紫外燈)進行照射,要注意實驗室的通風換氣。

    6 Measure(測)

    “測”是指為了提高檢測結(jié)果準確性和可靠性所采取的有關(guān)措施和活動。

    6.1 實驗室間質(zhì)評(EQA)

    也叫室間質(zhì)量評價,是國家衛(wèi)健委利用各實驗室間的比對來確定實驗室能力的活動,實際上它是指為確保實驗室維持較高的檢測水平而對其能力進行考核、監(jiān)督和確認的一種驗證活動。這是NGS實驗室證明自己能力的一種很好手段,也使自己實驗室技術(shù)能力走出行業(yè)的一個窗口,應(yīng)該積極報名參加。

    6.2 實驗室間比對

    實驗室間比對是按照預(yù)先規(guī)定的條件,由兩個或多個實驗室對相同或類似的測試樣品進行檢測的組織、實施和評價,從而確定實驗室能力、識別實驗室存在的問題與實驗室間的差異,是判斷和監(jiān)控實驗室能力的有效手段之一。

    6.3 人員比對

    為了提高自己實驗室人員的技能,建議定期開展人員比對,這是維持和提高檢驗人員能力水平的一種很好的手段。倡導(dǎo)實驗室形成你追我趕的氛圍,不斷提升實驗人員的技能。

    6.4 盲樣測試

    能直接反映實驗室的儀器設(shè)備和技術(shù)水平,可以作為實驗室技術(shù)人員轉(zhuǎn)正考核的一種手段。

    6.5 陽性對照和陰性對照

    每次檢測都必須放置陽性對照和陰性對照,作為最終判斷結(jié)果的參依據(jù)。陰性質(zhì)控品(NC)的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性,若其中有突變檢出,說明環(huán)境中可能存在DNA污染源。陽性質(zhì)控品(PC)的檢測結(jié)果應(yīng)為某個基因突變對應(yīng)陽性,如果突變未檢出,說明試劑盒性能不理想或操作過程有誤,此次檢測結(jié)果無效。

    7 結(jié)語

    隨著精準醫(yī)療的發(fā)展,NGS檢測有助于疾病的診斷分類,可以加深人們對疾病的認識,指導(dǎo)疾病的靶向治療,但是NGS檢測的質(zhì)量控制仍然存在問題:實驗室設(shè)計、實驗室人員水平、質(zhì)量保證手段等。我們只有有效運用“5M1E”分析法,規(guī)范NGS實驗室管理,保證質(zhì)量,向臨床提供真實、客觀、準確的檢測結(jié)果,才能更好的為大眾健康服務(wù)。

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