煙曲霉生物膜研究進(jìn)展

童建波 曾榮 李岷

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所 江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042)

由于廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛使用、放療和化療、器官移植以及侵入性治療措施的急劇增加、艾滋病等免疫缺陷性疾病的流行，侵襲性曲霉病的發(fā)病率在近年來快速上升[1]。盡管不少新型抗真菌藥物如兩性霉素B、伏立康唑、米卡芬凈等在體外對(duì)煙曲霉均顯示有較好的藥物敏感性，但臨床上療效卻往往不如體外試驗(yàn)?zāi)敲蠢硐?。?jù)統(tǒng)計(jì)該病的致死率可高達(dá)50%～95%[2]。在侵襲性肺曲霉病患者的支氣管肺泡灌洗液檢查和侵襲性曲霉病的患者尸體檢查中發(fā)現(xiàn)了存在一種特殊的膜樣形態(tài)結(jié)構(gòu),后證實(shí)這種膜樣結(jié)構(gòu)正是煙曲霉的生物膜形態(tài)[3],而該形態(tài)在體內(nèi)的出現(xiàn)也正是煙曲霉在體內(nèi)耐藥的重要原因之一。因此，近年來煙曲霉生物膜逐漸成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

1 煙曲霉生物膜的形成特點(diǎn)

目前研究生物膜的形成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要通過以下3種方式獲得生物膜模型：體外、體內(nèi)構(gòu)建生物膜模型及采集臨床自然形成的生物膜模型。典型的真菌生物膜形成階段主要包括：①真菌孢子黏附于載體接觸面；②微菌落的形成；③真菌細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，微菌落融合形成生物膜；④發(fā)育為成熟的生物膜；⑤真菌細(xì)胞和生物膜碎片播散形成新的生物膜[4]。

研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉生物膜形態(tài)好發(fā)于遺傳性肺功能異常的患者如肺囊性纖維化或慢性阻塞性肺疾病以及有外來器械植入物的患者如導(dǎo)管、假體、心臟起搏器、關(guān)節(jié)置換裝置、心臟瓣膜和乳房植入物等[5-6]。煙曲霉最初以孢子形式黏附在生物或非生物表面，菌絲體隨生物膜的成熟而生長，隨后由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)將生物膜融合成一體，形成均勻致密的三維立體結(jié)構(gòu)。Mowat E等[7]率先運(yùn)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板體外成功構(gòu)建煙曲霉生物膜模型，并使用激光共聚焦顯微鏡 (CLSM)動(dòng)態(tài)觀察生物膜的形成過程。隨后學(xué)者陸續(xù)嘗試使用兔、大鼠、猴、綿羊、小雞等多種動(dòng)物用來構(gòu)建侵襲性曲霉病的模型以開展闡明其發(fā)病機(jī)制、評(píng)價(jià)藥物療效、免疫預(yù)防以及尋找曲霉致病因子等多種研究[8-10]。

2 影響煙曲霉生物膜形成的因素

煙曲霉生物膜的形成受多種因素調(diào)控。附著材料不同將會(huì)影響生物膜的形成，如體外構(gòu)建生物膜模型時(shí)常采用橡膠導(dǎo)管、圓柱狀的纖維過濾器，不同材料制成的細(xì)管、玻片、塑料等，在不同基質(zhì)材料上形成的真菌生物膜量有所不同[11]。培養(yǎng)液的成分差異也會(huì)影響生物膜的形成，如血清可以促使煙曲霉菌絲的生長和生物膜的形成，在加有胎牛血清或胎球蛋白A的培養(yǎng)液中形成的煙曲霉生物膜厚度明顯增加，對(duì)多種抗真菌藥物耐藥性也明顯增強(qiáng)[12]。生物膜形成過程中群體感應(yīng)現(xiàn)象普遍存在，是指微生物自身群體密度的環(huán)境信號(hào)感受。生物膜是在信號(hào)分子精密監(jiān)控下的有組織的細(xì)胞群落。煙曲霉生物膜在形成過程中，細(xì)胞外的可擴(kuò)散自身感應(yīng)成分檢測(cè)并調(diào)節(jié)細(xì)胞總體密度，以利于生物膜的形成[13]。Exodenous DNA (eDNA)是成熟的煙曲霉生物膜細(xì)胞外基質(zhì)中的一種重要成分，對(duì)生物膜的形成及維持結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性起著重要的作用[14]。

3 煙曲霉生物膜的致病性

黏附是煙曲霉孢子致病性的第1步。胞外多糖GAG是煙曲霉生物膜黏附過程中關(guān)鍵的毒力因子，在介導(dǎo)生物膜形成的啟動(dòng)黏附中發(fā)揮著重要的作用[15]。疏水蛋白R(shí)odB、RodD、RodE、RodF作為煙曲霉細(xì)胞外基質(zhì)成分介導(dǎo)菌細(xì)胞相互黏附及對(duì)宿主的黏附，在煙曲霉生物膜形成過程中調(diào)控RodA、RodB、RodD蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)[16]。煙曲霉菌生物膜形成過程中，其營養(yǎng)代謝活性降低、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、膠霉毒素產(chǎn)生增加從而能夠很好逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，與懸浮狀態(tài)細(xì)胞相比，從生物膜中脫落的細(xì)胞致病力顯著增強(qiáng)[18]。

4 煙曲霉生物膜的耐藥機(jī)制

生物膜的一個(gè)顯著特性就是對(duì)各種抗真菌藥物的高度耐藥性。真菌生物膜對(duì)藥物的抵抗性是游離真菌的1 000倍[19]。真菌生物膜的耐藥機(jī)制由復(fù)雜的、多種機(jī)制共同參與，包括一些基本的物理性屏障作用和一些復(fù)雜的調(diào)控過程。

4.1 生物膜的屏障作用

生物膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)可能通過阻礙藥物擴(kuò)散而增加藥物抵抗性，研究發(fā)現(xiàn)曲霉菌生物膜外基質(zhì)的產(chǎn)生可降低藥物的抗菌作用。β-1，3葡聚糖在煙曲霉生物膜形成的早期起到藥物海綿的作用，而在生物膜的成熟期eDNA不僅促進(jìn)生物膜的成熟并保持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，而且在藥物抵抗上可能起到更重要的作用[20]。

4.2 耐藥基因的表達(dá)

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族和主要易化子超家族MFS是真菌主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族是1種ATP結(jié)合型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是主要外排蛋白，包括5個(gè)蛋白家族：其中多藥耐藥家族MDR、多藥耐藥相關(guān)蛋白家族MRP和多效性耐藥家族PDRI 3個(gè)蛋白家族與胞內(nèi)毒性物質(zhì)的外排密切相關(guān)；MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中也有兩個(gè)家族與外排毒性物質(zhì)功能相關(guān)。ABC和MFS的高表達(dá)可引起多種抗真菌藥尤其是三唑類抗真菌藥物交叉耐藥[21]。在煙曲霉生物膜中MDR1表達(dá)明顯上調(diào)[22]。相比于懸浮狀態(tài)，MFS在煙曲霉生物膜中也發(fā)現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)[23]。曲霉菌生物膜對(duì)伊曲康唑和伏立康唑的抵抗與流出泵基因AfuMDR4密切相關(guān)。麥角固醇生物合成基因Ergl是誘導(dǎo)特比萘芬耐受的作用靶點(diǎn)[24],在煙曲霉菌生物膜形成過程中，Erg基因表達(dá)增加，生物膜對(duì)特比萘芬的抵抗性增強(qiáng)[25]。

4.3 毒素蛋白的合成

在慢性曲霉菌感染中，產(chǎn)生的膠霉毒素等一些代謝產(chǎn)物有利于真菌逃避宿主的免疫反應(yīng)，生物膜中黑色素的產(chǎn)生也可影響曲霉菌的侵襲力及機(jī)體對(duì)曲霉菌的免疫反應(yīng)[26]。

4.4 生物膜中細(xì)胞的生長狀態(tài)

細(xì)胞的生長速度通常是藥物活性調(diào)節(jié)的一個(gè)重要因素，細(xì)胞生長速度越快，藥物的活性調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)[27]。由于營養(yǎng)獲得的限制，生物膜中的細(xì)胞生長緩慢或呈現(xiàn)饑餓狀態(tài)，真菌的代謝速率降低表現(xiàn)出真菌細(xì)胞對(duì)抗真菌藥物的不敏感。

5 觀察煙曲霉生物膜常用的形態(tài)學(xué)的常用方法

對(duì)真菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)的觀察主要借助于各種顯微技術(shù)的應(yīng)用，如掃描電鏡、熒光電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡等。

5.1 掃描電鏡

掃描電鏡是目前最直觀、常用觀察生物膜的方法之一，無須切片就可直接觀察生物膜中菌絲、多糖的分布情況。 Alejandra等[6]通過掃描電鏡分別觀察28℃和37℃體外煙曲霉生物膜的動(dòng)態(tài)生長周期，煙曲霉生物膜4 h開始孢子黏附于并分泌聚合物質(zhì)。8～12 h時(shí)孢子萌芽，產(chǎn)生菌絲并延長，有趣的是在28℃時(shí)更多的是形成微菌落。16～20 h菌絲開始形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并可以觀察到通道形成，這也就為生物膜提供了一個(gè)營養(yǎng)物質(zhì)代謝的通道。24 h就可以形成一個(gè)具有復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)特征的成熟的生物膜結(jié)構(gòu)，菌絲有序排列，大量細(xì)胞外基質(zhì)分布在菌絲的周圍，只有在成熟期的生物膜才開始出現(xiàn)孢子的擴(kuò)散。 特別值得提出的是Alejandra等[28]認(rèn)為煙曲霉生物膜的最佳孢子濃度為1×106CFU/mL，這和之前的文獻(xiàn)報(bào)道觀點(diǎn)不同[8]，可能的原因是在體外構(gòu)建生物膜時(shí)與所選用的材料不同有關(guān)。CourCtney等[29]運(yùn)用電鏡觀察煙曲霉生物膜結(jié)構(gòu)的同時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著生物膜的成熟，ECM逐漸在菌絲間延伸積累并緊密包裹住生物膜。

5.2 激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)用于觀察生物膜形態(tài)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅能對(duì)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或組織的某一層面分別獲取其各色熒光的清晰圖像，對(duì)于一定厚度的生物膜能各層面逐層掃描攝影，經(jīng)軟件處理，可以得到生物膜的色彩立體圖像及計(jì)算機(jī)動(dòng)畫演示。對(duì)生物膜的厚度、比表面積、均一性及各種熒光的強(qiáng)度等多個(gè)參數(shù)進(jìn)行量化比較，即可方便的獲取到真菌形成生物膜動(dòng)態(tài)過程的各種量化數(shù)據(jù)[30]。Villena等[31]使用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，用熒光染料FITC-FUN1標(biāo)記多糖，用CLSM連續(xù)逐層掃描圖像行三維重建，動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)煙曲霉生物膜形成中菌絲呈現(xiàn)嚴(yán)密的極性生長。我們?cè)谇捌诘难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)在低熱作用下可以破壞煙曲霉生物膜的極性生長。成熟的生物膜是細(xì)胞外基質(zhì)包裹下的由孢子、菌絲體組成的均一致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。完整成熟的煙曲霉生物膜結(jié)構(gòu)厚度通?？梢缘竭_(dá)200 μm左右[32]。

上述兩種技術(shù)在生物膜的檢測(cè)中應(yīng)用甚廣，掃描電鏡的優(yōu)點(diǎn)是能直接觀測(cè)生物膜中細(xì)胞的情況，但需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水、固定、包埋、染色等處理，這樣就破壞了生物膜的完整性，可能會(huì)導(dǎo)致觀察結(jié)果與實(shí)際有差異，而激光共聚焦顯微鏡恰好可以彌補(bǔ)這一不足。但兩者都只能通過直觀視覺來判斷，沒有很好的量化標(biāo)準(zhǔn)。

6 測(cè)定煙曲霉生物膜常用的生物膜量及活力的常用方法

6.1 結(jié)晶紫分光光度法 (CV法)

CV法是對(duì)真菌生物膜培養(yǎng)后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色后沖洗、脫色后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)脫色液在某一波長光波的吸收值，計(jì)算染色菌體數(shù)量對(duì)真菌生物膜形成進(jìn)行粗略定量分析的方法。Vinícius等[33]在96孔板中接種煙曲霉菌懸液37℃培養(yǎng)24 h后運(yùn)用結(jié)晶紫染色后在570 nm波長測(cè)定煙曲霉生物膜形成量，對(duì)比觀察ΔsitA對(duì)生物膜形成的影響的。其缺點(diǎn)是不能做到很好地區(qū)分生物膜中活菌和死菌及細(xì)胞外基質(zhì)，不能準(zhǔn)確地反映生物膜的活力，但仍然可以較好地顯示動(dòng)態(tài)對(duì)比中生物膜總生成量的變化。

6.2 MTT即四氮唑鹽減低法

MTT在活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶作用下代謝還原，不溶于水的藍(lán)色或藍(lán)紫色甲臜在細(xì)胞色素C的作用下生成并沉積在細(xì)胞中，通過二基亞砜 (DMSO)溶解細(xì)胞中的甲瓚，就可以在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定甲臜的含量。活細(xì)胞數(shù)與甲臜產(chǎn)生量呈正相關(guān)，因此活細(xì)胞的數(shù)目可根據(jù)吸光值推測(cè)出。MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測(cè)儀器，無放射性同位素，適合大批量檢測(cè)的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。

6.3 XTT減低法

是目前研究生物膜最為常用的方法,XTT 即甲基四氮鹽是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，活細(xì)胞線粒體中存在與輔酶Ⅱ相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的XTT還原成水溶性的橘黃色的四氮鹽-甲臜產(chǎn)物，該代謝產(chǎn)物能溶解在組織培養(yǎng)基中，在490 nm處的吸光值與細(xì)胞的活力成正比。該法在不破壞生物膜的條件下能檢測(cè)出生物膜中菌細(xì)胞的活力。優(yōu)點(diǎn)在于XTT及其產(chǎn)物有良好的水溶性，給實(shí)驗(yàn)操作帶來極大的方便，而且可以不破壞生物膜的完整結(jié)構(gòu)來研究生物膜中菌細(xì)胞的活性，另外它還具有使用方便、不用洗滌細(xì)胞、檢測(cè)快速的特點(diǎn)，因此，XTT法在研究真菌細(xì)胞生物膜的生長動(dòng)力學(xué)和耐藥性方面得到了極為廣泛的應(yīng)用[34]。

多種熒光染料方法可用于生物膜的量及活力測(cè)定。綠色熒光核酸染料Syto9和刃天青顯色法適用于生物膜活力測(cè)定，二甲基亞甲基藍(lán)DMMB比色法和熒光素FDA法也較好的應(yīng)用于檢測(cè)生物膜形成的總量[35]。

7 結(jié) 語

目前對(duì)煙曲霉生物膜的基本結(jié)構(gòu)和特性有了初步的了解，但仍然存在很多問題有待解決，如它的信號(hào)群感系統(tǒng)的建立、確切的耐藥機(jī)制及現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的真菌/細(xì)菌混合性生物膜的特性等，進(jìn)一步了解煙曲霉的生物膜形成機(jī)制和耐藥機(jī)制、明確生物膜在致病和耐藥方面的遺傳學(xué)機(jī)制；對(duì)其進(jìn)一步的研究有助于指導(dǎo)臨床治療、降低死亡率、改善預(yù)后。

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