三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注對內(nèi)毒素誘導(dǎo)發(fā)熱模型大鼠體溫及血清IL-6、MIP-1含量的影響

王曉燕 湯瑞蓮 劉寶琴 韓升波 王慧明 李小艷 何潔鑫 李 晶

（1.河南省鄭州市中醫(yī)院，河南 鄭州 450007；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008）

小兒外感發(fā)熱是兒科常見病、多發(fā)病，全年均可發(fā)病，治療失當(dāng)可誘發(fā)驚厥的發(fā)生，或轉(zhuǎn)為肺炎、心肌炎等，給患兒帶來極大的痛苦，也給家長帶來極大困擾，故研發(fā)治療此病的藥物及給藥途徑非常必要。三陽清解液由筆者依據(jù)張仲景《傷寒論》六經(jīng)辨證理論，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，總結(jié)二十多年臨床經(jīng)驗(yàn)，參閱大量醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)，多方篩選，精心設(shè)計(jì)，在《傷寒六書》柴葛解肌湯、《傷寒雜病論》的大柴胡湯、白虎湯基礎(chǔ)上衍化而來。筆者用三陽清解煎劑直腸滴注治療小兒外感發(fā)熱 （風(fēng)熱夾滯型）取得了較好的臨療效，具有起效快、療效好、體溫不易返彈、伴隨癥狀緩解明顯、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)［1］。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射脂多糖（LPS）制作大鼠發(fā)熱模型，并觀察三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注對發(fā)熱模型大鼠體溫及血清中致熱性細(xì)胞因子的影響，旨在探討三陽清解液的退熱作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g；購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：11400700164869。

1.2 試藥與儀器 脂多糖（LPS）（100mg），批號530F032，購自索萊寶科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（96T）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1（MIP-1）ELISA 試劑盒（96T），批號：20150807A，深圳子科生物科技有限公司。三陽清解液低劑量組：葛根5 g，柴胡8 g，黃芩 6 g，生石膏 20 g，生梔子 8 g，莪術(shù) 5 g，生大黃4 g，甘草3 g。以上為1劑量，水煎、過濾和濃縮，制備濃縮成生藥質(zhì)量60 g/mL的水煎液，裝瓶備用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)制所需濃度。三陽清解液中劑量組生藥質(zhì)量濃度為120 g/mL；三陽清解液高劑量組生藥質(zhì)量濃度為180 g/mL；由鄭州市中醫(yī)院制劑室提供。泰諾林混懸液（對乙酰氨基酚口服混懸液），規(guī)格：3.2 g/100 mL，批號：160123070，上海強(qiáng)生制藥有限公司生產(chǎn)。HW-1000超級恒溫水浴，成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)；TDL80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；BT100-2J蠕動泵驅(qū)動器，保定蘭格恒流泵有限公司生產(chǎn)；IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具，蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司生產(chǎn)；MC-347歐姆龍電子體溫計(jì)，大連歐姆龍有限公司生產(chǎn)；Spectra Max190型酶標(biāo)儀（美國熱電）。

1.3 動物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)前，每日上下午定時（上午8∶30，下午4∶30開始）對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性測量口腔溫度1次，連續(xù)2 d，取兩次體溫的平均值記為基礎(chǔ)體溫（T0）。測量時保持時間、地點(diǎn)、環(huán)境條件的一致性，測量探頭從大鼠口角插入口腔舌下并保證每次定位角度一致，動作輕柔防止體溫應(yīng)激性增高。體溫超過正常范圍或相鄰兩次體溫差值大于0.5℃的大鼠剔除。選用基礎(chǔ)體溫合格的大鼠48只，隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、陽性對照組、三陽清解液高劑量組、三陽清解液中劑量組、三陽清解液低劑量組，每組8只，雌雄各半。

1.4 給藥方法 給藥前12 h各組大鼠禁食不禁水，以減少糞便對藥物的干擾。實(shí)驗(yàn)前30 min打開恒溫循環(huán)水浴，使循環(huán)水溫恒定在37℃，用于加熱乙狀結(jié)腸滴注的受試藥物，調(diào)整好恒速蠕動泵速度，三陽清解液各劑量組分別將配置好的受試藥物加入到麥?zhǔn)虾銣厮〔蹆?nèi)溫浴至37℃，恒溫浴槽藥物出口連接12號導(dǎo)尿管，通過蠕動泵將藥物勻速滴注至乙狀結(jié)腸。三陽清解液低、中、高劑量組生藥質(zhì)量濃度分別為60、120、180 g/mL,給藥量按30 mL/kg體質(zhì)量計(jì)算，約以20滴/min的速度乙狀結(jié)腸滴注給藥?？瞻捉M：腹腔注射生理鹽水1 mL/kg體質(zhì)量。模型組：腹腔注射生理鹽水；陽性對照組：對乙酰氨基酚口服混懸液，按4 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥。

1.5 模型制備 致熱源制備：無菌條件下，用0.9%氯化鈉溶液將脂多糖（LPS）配成20 mg/L注射液，備用。乙狀結(jié)腸滴注給藥后立即造模：空白組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1 mL/kg，其余各組大鼠分別腹腔注射LPS（20 μg/kg，1 mL/kg）建立大鼠發(fā)熱模型。

1.6 觀察指標(biāo) 各組動物從造模0.5 h開始測體溫（Ti），以后每隔1 h測1次體溫，連續(xù)監(jiān)測6.5 h。計(jì)算△T（△T=Ti-T0）。測量體溫的同時，觀察大鼠皮膚、毛色、肢體、精神狀況、飲食、飲水、大小便、呼吸、體溫、體質(zhì)量的變化情況。

1.7 標(biāo)本采集與檢測 各組大鼠于給藥后6.5 h將大鼠麻醉后，采用腹主動脈采血5 mL留取血標(biāo)本，然后以3000 r/min，離心15 min，分離血清，置于-80℃冰箱冷凍，待ELISA檢測IL-6、MIP-1用。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組樣本間差異用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠給藥6.5 h內(nèi)體溫變化趨勢 見表1。結(jié)果示，腹腔注射 LPS（20 μg/kg）后，模型大鼠體溫較空白組顯著升高（P＜0.01），最高時（5.5 h）升溫值達(dá)到1.37℃。三陽清解液各劑量組在給藥及造模后0.5 h可見體溫下降。三陽清解液各劑量組與模型組相比溫度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且退熱效果存在一定的劑量依賴關(guān)系，三陽清解液高劑量組退熱效果優(yōu)于中劑量組和低劑量組。實(shí)驗(yàn)過程中觀察到部分發(fā)熱模型大鼠出現(xiàn)豎毛、寒顫、精神萎靡的癥狀，部分大鼠甚至伴有輕微腹瀉，表明LPS成功誘導(dǎo)了大鼠的發(fā)熱模型，與鄒甜［2］、高陽［3］前期報(bào)道一致。模型組與空白組比較，模型組大鼠體溫明顯升高，每個時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），亦說明造模成功。

表1 各組大鼠體溫△T比較（℃，±s）

表1 各組大鼠體溫△T比較（℃，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.01。 下同。

組 別 n 0.5 h 1.5 h 2.5 h 3.5 h 4.5 h 5.5 h 6.5 h空白組 8 -0.04±0.23 0.12±0.18 0.08±0.180.18±0.20 0.11±0.25 0.09±0.30 0.06±0.26模型組 8 0.64±0.36 0.74±0.17△ 0.92±0.21△ 0.81±0.21△ 0.72±0.35△ 1.04±0.33△ 0.75±0.28△陽性對照組 8 0.39±0.27 0.21±0.31**0.20±0.19**0.45±0.21**0.44±0.23**0.51±0.26*0.50±0.26*三陽清解液高劑量組 8 0.21±0.42**0.61±0.93 0.58±0.61**0.36±0.41**0.40±0.47**0.30±0.46**0.34±0.33**三陽清解液中劑量組 8 -0.56±0.36**-0.03±0.73**0.17±0.54**0.39±0.37**0.54±0.30*0.64±0.26**0.51±0.18*三陽清解液低劑量組 8 0.04±0.16**0.56±0.38*0.74±0.38*0.57±0.43*0.61±0.27 0.79±0.27*0.67±0.35

2.2 給藥后各組大鼠血清中細(xì)胞因子水平比較 見表2。造模給藥6.5 h后，模型組動物血清中IL-6、MIP-1含量較空白組升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組及三陽清解液高劑量組能夠減低發(fā)熱大鼠血清中 IL-6、MIP-1 的含量（P＜0.01），三陽清解液中劑量組對發(fā)熱大鼠血清中IL-6、MIP-1的水平也有一定的抑制作用（P＜0.05）；而三陽清解液低劑量組對發(fā)熱大鼠血清中IL-6的水平有抑制作用 （P＜0.05），但MIP-1的水平無明顯降低。

表2 各組大鼠血清中IL-6、MIP-1水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清中IL-6、MIP-1水平比較（pg/mL，±s）

組 別 n IL-6 MIP-1空白組 8 193.66±47.17 212.82±72.54模型組 8 276.52±35.40△ 327.46±43.56△陽性對照組 8 207.22±54.27** 235.90±75.42**三陽清解液高劑量組 8 213.15±35.64** 242.16±87.66**三陽清解液中劑量組 8 221.11±54.53* 268.96±85.07*三陽清解液低劑量組 8 228.98±52.55* 289.39±83.37

3 討 論

發(fā)熱是在致熱性細(xì)胞因子作用下使體溫調(diào)節(jié)中樞的調(diào)定點(diǎn)上移而引起的調(diào)節(jié)性體溫升高，是兒科疾病常見的臨床癥狀之一。IL-6、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、MIP-1、腫瘤壞死因子（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子及其受體之間相互聯(lián)系、相互影響，作用于全身或局部從而參與發(fā)熱反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥過程、參與免疫調(diào)節(jié)、影響組織代謝等生物效應(yīng)。尤其IL-1β、MIP-1和IL-6是公認(rèn)的可誘導(dǎo)發(fā)熱的重要炎性遞質(zhì)［4-8］。

目前一般采用注射某種致熱源制作大鼠發(fā)熱模型，本實(shí)驗(yàn)選用比較常用的、成熟的方法，采取尾腹腔注射LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱。LPS是革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的活性成分，有高度水溶性，動物體內(nèi)能引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致發(fā)熱效應(yīng)很強(qiáng)的外源性致熱源，它能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)生性致熱原，從而使體溫升高［9-10］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱時注射劑量為20 μg/kg時可引起典型的雙峰熱，與前期報(bào)道［11-12］一致，且發(fā)熱反應(yīng)均勻、持續(xù)時間長，是造模的最佳劑量［13-15］。在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中我們參照前期報(bào)道［16］采用測肛溫的方法，發(fā)現(xiàn)三陽清解液乙狀結(jié)腸滴注時后反復(fù)測肛溫會刺激大鼠肛門，引起不適，致灌腸藥物流出，影響藥物效果及體溫測定，所以我們采用測口溫的方法，此為創(chuàng)新點(diǎn)之一；另外，大鼠在灌腸過程中因?yàn)楦箟哼^大等，造成滴注緩慢或不滴等現(xiàn)象，我們采用恒流泵泵入的方法解決這一問題，此為創(chuàng)新點(diǎn)之二；同時使用恒溫水浴保證藥物在37℃作用，此為創(chuàng)新點(diǎn)之三。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為小兒外感發(fā)熱主要是感受風(fēng)邪所致，有風(fēng)寒、風(fēng)熱之分。因小兒是“純陽之體”，感邪之后易于化熱，故臨床上風(fēng)熱證型最為常見。而小兒臟腑薄、藩籬疏，易于傳變，往往太陽表證未解而病邪即入少陽半表半里，正邪交爭，引動膽經(jīng)郁熱，上迫心神，橫逆犯胃，而致小兒就診時大多太陽、少陽、陽明諸癥并見。三陽清解液正是在 《傷寒六書》柴葛解肌湯、《傷寒雜病論》的大柴胡湯、白虎湯基礎(chǔ)上衍化而來，主要用于治療小兒外感發(fā)熱（風(fēng)熱夾滯型），方中柴胡輕清升散，黃芩清瀉相火，和解少陽；葛根辛涼，解表入太陽；大黃瀉熱通便蕩滌陽明腑熱；石膏甘寒，清解陽明氣分熱邪；梔子苦寒，能清三焦?jié)駸?。全方共奏辛涼解表、和解少陽、清瀉陽明之效。最妙在方中加入莪術(shù)，其意有四：一用其活血化瘀之功，增進(jìn)藥物的吸收；二用其消積行氣之能，增強(qiáng)患兒的食欲；三取其苦溫辛散之性，反佐上藥過于寒涼之弊；四取其揮發(fā)油抑制病毒、細(xì)菌及增強(qiáng)免疫之效，從而全面提高藥物療效。

前期臨床研究證實(shí)［1］三陽清解煎劑直腸滴注治療小兒外感發(fā)熱療效顯著，在治療過程中沒有觀察到明顯不良反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹荚谔接懺撊柷褰庖旱耐藷嶙饔脵C(jī)制，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，三陽清解液各劑量組和對乙酰氨基酚對照組均對LPS發(fā)熱大鼠模型有退熱效果。三陽清解液各劑量組與模型組相比溫度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且退熱效果存在一定的劑量依賴關(guān)系，三陽清解液高劑量組退熱效果優(yōu)于中劑量組和低劑量組。三陽清解液高劑量組能夠明顯減低發(fā)熱大鼠血清中IL-6、MIP-1的含量，三陽清解液中劑量組對發(fā)熱大鼠血清中IL-6、MIP-1的水平也有一定的抑制作用等，據(jù)此可認(rèn)為三陽清解液具有降低LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型血清中IL-6、MIP-1含量的功效，在一定劑量范圍內(nèi)，三陽清解液的這些功效與其藥物劑量呈正相關(guān)。綜上所述，三陽清解液對LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱大鼠模型有良好的解熱作用，且有較好的劑量依賴性，其解熱效果可能與其抑制發(fā)熱大鼠血清中致熱細(xì)胞因子IL-6、MIP-1的含量相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)對三陽清解液的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討，但是致熱細(xì)胞因子的作用機(jī)制非常復(fù)雜，其含量和作用也會相互影響，三陽清解液是如何抑制這些致熱細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放，是否通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程而抑制合成等，有待今后進(jìn)一步研究。

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