不同壓力灌注下上尿路梗阻大鼠的腎損傷程度

黃 倩,柳懿鵬

武漢市第一醫(yī)院泌尿外科 武漢 430022

經(jīng)皮腎鏡碎石術(shù)、輸尿管鏡碎石術(shù)等微創(chuàng)手術(shù)已經(jīng)成為治療上尿路結(jié)石的主要手術(shù)方法，其創(chuàng)傷小,并發(fā)癥少,患者術(shù)后恢復(fù)快[1]。這些手術(shù)過(guò)程中均需要沖水以保持視野清晰并幫助排出碎石。有研究[2]報(bào)道當(dāng)腎盂壓力超過(guò)30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時(shí)會(huì)導(dǎo)致腎盂靜脈以及淋巴管反流，而經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)腎盂灌注壓力常常大于350 mmHg，如此高的灌注壓力可能會(huì)導(dǎo)致腎功能損害[3]。很多結(jié)石患者術(shù)前已經(jīng)合并有不同程度的上尿路梗阻，可能已經(jīng)存在腎功能受損[4]。梗阻的腎臟可能會(huì)對(duì)術(shù)中操作過(guò)程中的灌注壓力更敏感。因此，我們通過(guò)構(gòu)建大鼠模型，觀察上尿路梗阻程度是否影響腎臟對(duì)灌注壓力的耐受能力。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組從華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買80只7周齡雄性SD大鼠(生產(chǎn)批號(hào)：2016SD109)，體重180 g左右。按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法飼養(yǎng)1周。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常大鼠灌注壓力達(dá)100 mmHg時(shí)可發(fā)生腎組織損傷。隨機(jī)將動(dòng)物分成8組，每組10只。其中4組(M0～M3組)進(jìn)行造模形成輕度上尿路梗阻，然后分別給予0、20、60、100 mmHg壓力的腎盂灌注。剩余4組(S0～S3)進(jìn)行造模形成重度上尿路梗阻，然后分別給予0、20、60、100 mmHg壓力的灌注。

1.2手術(shù)操作方法大鼠禁飲食8 h，稱重后，按30 mg/kg腹腔內(nèi)注射戊巴比妥麻醉。通過(guò)腹部正中切口暴露左側(cè)輸尿管、腰大肌。分離腰大肌，將輸尿管包埋在腰大肌內(nèi)約1 cm長(zhǎng)(輕度組)或3 cm長(zhǎng)(重度組)[4]，然后關(guān)閉腹腔。2周后，用超聲波檢查腎盂積水情況，記錄腎盂擴(kuò)張程度和腎實(shí)質(zhì)厚度。然后再次手術(shù)，暴露積水的腎盂，將0.7G頭皮針插入腎盂并連接壓力記錄儀(Biopac，CA)以記錄腎盂內(nèi)壓力，再將另一個(gè)0.7G頭皮針插入腎盂并連接壓力泵，用37 ℃生理鹽水按相應(yīng)壓力進(jìn)行灌注。灌注8 min后停止2 min，重復(fù)操作4次。然后將包埋入腰大肌的一段輸尿管松解出來(lái)，關(guān)閉腹腔。

1.3取材術(shù)后48 h處死大鼠，收集左腎，橫向切分腎組織，然后用福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(瑞士Roche Applied Science公司)檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，即為凋亡指數(shù)[5]。

1.4.2 腎損傷分子1(kidney injury molecule 1,KIM-1)和富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,Cyr61)檢測(cè) 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，水化，微波抗原修復(fù)及抑制內(nèi)源性酶后，加一抗NGAL(加拿大Santa Cruz Biotechnology公司)于4 ℃潮濕恒溫箱中孵育過(guò)夜；然后將生物素化的二抗、辣根過(guò)氧化物酶及3,30-二氨基聯(lián)苯等按照說(shuō)明書(shū)加入；蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇純化，乙醇脫水，二甲苯清洗，然后裝入凝膠。于光鏡(100倍)下觀察。每個(gè)視野選擇5個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域觀察100個(gè)腎小管上皮細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞(染成棕色的細(xì)胞)百分比并進(jìn)行評(píng)分：沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)為0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤20%為1分， >20%且≤50%為2分，>50%且≤75%為3分，>75%為4分[6]。

1.5數(shù)據(jù)處理使用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。輕度和重度梗阻大鼠腎盂擴(kuò)張程度和腎實(shí)質(zhì)厚度的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)、KIM-1和Cyr61表達(dá)評(píng)分進(jìn)行2×4析因設(shè)計(jì)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1造模情況輸尿管包埋2周后，用超聲波檢查腎盂積水情況。輕度、重度梗阻組腎盂擴(kuò)張程度分別為(0.27±0.05) cm和(0.51±0.07) cm，腎實(shí)質(zhì)厚度分別為(0.27±0.04) cm和(0.20±0.03) cm，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.258，P=0.006；t=3.756，P=0.005)，說(shuō)明造模結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)見(jiàn)圖1、表1。可以看出梗阻程度越重，灌注壓力越高，腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)越高；提示梗阻越重，越可能在較低的灌注壓力下出現(xiàn)高的凋亡指數(shù)。

1～4：灌注壓分別為0、20、60、100 mmHg；A：輕度梗阻；B：重度梗阻圖1 8組腎組織腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況(×100)

梗阻程度灌注壓0mmHg20mmHg60mmHg100mmHg輕度0．211±0．0520．226±0．0580．239±0．0640．623±0．116重度0．329±0．0910．313±0．1050．653±0．0870．676±0．118

F梗阻程度=69.528，F(xiàn)灌注壓=81.051，F(xiàn)交互=16.479，P均<0.001

2.3腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1和Cyr61的表達(dá)見(jiàn)圖2、3和表2、3。梗阻程度越重，灌注壓力越高，KIM-1和Cyr61的表達(dá)越高；提示梗阻越重，越可能在較低的灌注壓力下出現(xiàn)高的KIM-1和Cyr61表達(dá)。

1～4：灌注壓分別為0、20、60、100 mmHg；A：輕度梗阻；B：重度梗阻圖2 各組腎組織腎小管上皮細(xì)胞KIM-1的表達(dá)情況(SP，×100)

1～4：灌注壓分別為0、20、60、100 mmHg；A：輕度梗阻；B：重度梗阻圖3 各組腎組織腎小管上皮細(xì)胞Cyr61的表達(dá)情況(SP，×100)

梗阻程度灌注壓0mmHg20mmHg60mmHg100mmHg輕度1．209±0．5261．334±0．6791．356±0．7133．652±0．839重度1．482±0．2731．521±0．3063．792±0．6273．926±0．711

F梗阻程度=33.143，F(xiàn)灌注壓=69.521，F(xiàn)交互=15.699，P均<0.001

表3 腎小管上皮細(xì)胞Cyr61的表達(dá)(n=10)

F梗阻程度=52.901，F(xiàn)灌注壓=110.146，F(xiàn)交互=28.233，P均<0.001

3 討論

腎盂高灌注壓力對(duì)腎臟造成的損傷受到越來(lái)越多的重視。研究[2，7-8]證實(shí)，當(dāng)腎盂灌注壓力超過(guò)30 mmHg持續(xù)10 min可導(dǎo)致腎盂淋巴、靜脈的逆流，嚴(yán)重的逆流可導(dǎo)致體溫過(guò)低、膿毒血癥、心血管疾病、腎損傷的發(fā)生。在本研究中，我們觀察到，上尿路梗阻程度越嚴(yán)重，導(dǎo)致大鼠腎臟損傷的灌注壓力閾值越低。這表明，嚴(yán)重梗阻的腎臟對(duì)腎盂灌注壓力的耐受能力下降，更容易在輸尿管鏡、經(jīng)皮腎鏡等手術(shù)操作過(guò)程中發(fā)生急性腎損傷。

腎小管上皮細(xì)胞在鹽和水重吸收、代謝產(chǎn)物的排泄方面具有重要作用，其受損將導(dǎo)致腎功能下降[8]。KIM-1是一種跨膜蛋白，在正常腎臟不表達(dá)，在腎損傷時(shí)表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，是常用的腎小管損傷生物標(biāo)志[9]。Cyr61在所有類型的血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，其作用是調(diào)節(jié)增殖、遷移以及血管內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞的黏附。Cyr61對(duì)傷口愈合、組織重構(gòu)具有促進(jìn)作用[10]。KIM-1及Cyr61表達(dá)升高提示腎組織缺血受損。

本實(shí)驗(yàn)旨在模擬結(jié)石導(dǎo)致的不同程度的上尿路梗阻患者在進(jìn)行經(jīng)皮腎鏡或輸尿管鏡手術(shù)治療過(guò)程中，腎盂受到各種壓力灌注時(shí)出現(xiàn)的腎損傷情況。初期的獨(dú)立腎臟模型實(shí)驗(yàn)中，灌注后動(dòng)物模型容易發(fā)生死亡；此外在臨床實(shí)際中，孤立腎并腎結(jié)石患者相對(duì)較少。因此本實(shí)驗(yàn)中大鼠兩個(gè)腎臟僅一個(gè)被造成上尿路梗阻模型并進(jìn)行灌注實(shí)驗(yàn)，而另一個(gè)腎臟未被切除。但這種造模方法不能利用血清肌酐水平衡量腎功能受損情況，因此我們使用KIM-1和Cyr61來(lái)評(píng)價(jià)腎小管上皮細(xì)胞的損傷程度[11]。雖然動(dòng)物模型仍存在一定的局限性，大鼠腎臟與人類腎臟對(duì)腎盂灌注的耐受力不一樣[12]，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)上尿路梗阻存在時(shí)，腎盂灌注更容易造成急性腎損傷，梗阻程度越重，對(duì)于腎盂灌注壓力的耐受越差。今后可在臨床上進(jìn)行相關(guān)研究，同時(shí)針對(duì)不同程度腎積水探索最佳腎盂灌注壓力區(qū)間，以減輕手術(shù)中急性腎損傷，同時(shí)保持良好的視野，實(shí)現(xiàn)更快、更徹底、更安全的碎石。

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