LncRNA MEG3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

劉 珂，侯 毅，鄭 稼

河南省人民醫(yī)院骨科 鄭州 450003

LncRNA MEG3(MEG3)是一個(gè)定位于人類14q32位點(diǎn)的母源性印記基因，全長(zhǎng)約1 700個(gè)核苷酸，在正常組織中普遍表達(dá)，尤其在腦和垂體中高表達(dá)。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)MEG3在胃癌、胰腺癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，推測(cè)MEG3可能具有抑癌作用。已有研究證實(shí)MEG3的異常表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤[3]、卵巢上皮瘤[4]等腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。最近，有研究[5]報(bào)道，MEG3在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著下降，并且與患者的存活狀態(tài)關(guān)系密切。該研究對(duì)MEG3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1主要試劑人MEG3合成和pcDNA3.0-MEG3質(zhì)粒的構(gòu)建均由上海吉瑪制藥有限公司完成。MEG3上游引物序列為5’-ATCCGTCCACCTTGTCT-3’，下游引物序列為5’-CCTCTTCATCCTTTGCCATC-3’，產(chǎn)物大小195 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipfectamine2000、SYBR-Green Ⅰ、Trizol試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司，Transwell購(gòu)自Corning公司，CCK-8購(gòu)自碧云天生物科技公司。

1.2細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)正常成骨細(xì)胞hFOB1.19，骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、U-2 OS 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。復(fù)蘇細(xì)胞后，使用含G418(終濃度為0.3 mol/L)的DMEM/F12等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)hFOB1.19，使用RPMI 1640、DMEM分別培養(yǎng)MG-63和U-2 OS。所有培養(yǎng)基均含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，以使細(xì)胞保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。

1.3細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分別收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63和U-2 OS細(xì)胞，接種于6孔板，利用Lipfectamine2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.0和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平的檢測(cè)采用qRT-PCR法。收集hFOB1.19、pcDNA3.0-MEG3轉(zhuǎn)染的MG-63、U-2 OS細(xì)胞以及相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞，使用Trizol裂解并提取總RNA，取4 μg總RNA使用AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，然后使用SYBR-Green Ⅰ試劑盒在Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀(德國(guó)Qiagen公司)上進(jìn)行MEG3擴(kuò)增。反應(yīng)體系：1 μL cDNA，0.5 μL引物，2 μL Buffer，1 μL dNTPs，0.5 μL Taq酶，1 μL SYBR-Green Ⅰ以及14 μL RNase-free水。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。用2-ΔΔCt法計(jì)算MEG3的相對(duì)表達(dá)量。

1.5細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)收集pcDNA3.0-MEG3或空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG-63、U-2 OS細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，加入適量培養(yǎng)基重懸，接種到96孔板，每孔100 μL懸液(約104個(gè)細(xì)胞/孔)，每種細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔；分別于培養(yǎng)0、24、48和72 h后，向各孔中加入10 μL預(yù)配制的CCK-8溶液，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 h，然后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)收集pcDNA3.0-MEG3或空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG-63、U-2 OS細(xì)胞，離心，使用不含血清和雙抗的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞使其密度在5×105mL-1。在Transwell小室的下室加入對(duì)應(yīng)的完全培養(yǎng)基600 μL，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，無(wú)水乙醇固定、1 g/L結(jié)晶紫染色各10 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞凋亡的檢測(cè)收集pcDNA3.0-MEG3或空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG-63、U-2 OS細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，離心后棄上清，加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞使?jié)舛冗_(dá)到106mL-1，取190 μL細(xì)胞液、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料混勻后避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組間MEG3相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間穿膜細(xì)胞數(shù)、凋亡率的比較，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞中MEG3相對(duì)表達(dá)量的比較hFOB1.19、MG-63及U-2 OS細(xì)胞中MEG3相對(duì)表達(dá)量分別為(0.92±0.02)、(0.61±0.19)和(0.56±0.14)；3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.102，P=0.036)，MG-63及U-2 OS細(xì)胞中MEG3相對(duì)表達(dá)量較hFOB1.19細(xì)胞降低(P<0.017)。pcDNA3.0-MEG3轉(zhuǎn)染的MG-63、U-2 OS細(xì)胞中MEG3相對(duì)表達(dá)量均高于空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組，見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3 前后骨肉瘤細(xì)胞中MEG3相對(duì)表達(dá)量的比較

*：與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組相比，P<0.001

2.2轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3的MG-63和U-2OS細(xì)胞增殖能力的變化細(xì)胞增殖曲線見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3的MG-63、U-2 OS細(xì)胞的增殖能力弱于空質(zhì)粒組。

上：MG-63細(xì)胞；下：U-2 OS細(xì)胞；A：空質(zhì)粒組；B：pcDNA3.0-MEG3轉(zhuǎn)染組圖1 細(xì)胞增殖曲線

2.3轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3的MG-63和U-2OS細(xì)胞遷移能力和凋亡率的變化pcDNA3.0-MEG3轉(zhuǎn)染的MG-63和U-2 OS細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少于空質(zhì)粒組(圖2，表2)，細(xì)胞凋亡率高于空質(zhì)粒組(表2)。

A：MG-63細(xì)胞；B：U-2 OS細(xì)胞；1：空質(zhì)粒組；2：pcDNA3.0-MEG3轉(zhuǎn)染組圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

組別nMG?63穿膜細(xì)胞數(shù)凋亡率/%U?2OS穿膜細(xì)胞數(shù)凋亡率/%空質(zhì)粒組376．0±6．03．5±0．374．0±2．03．7±0．2pcDNA3．0?MEG3轉(zhuǎn)染組3147．2±8．130．7±1．2137．7±8．635．1±1．2t12．33430．88013．54035．660P<0．001<0．001<0．001<0．001

*：與空質(zhì)粒組相比，P<0.01。

3 討論

MEG3是一個(gè)具有重要抑癌作用的LncRNA。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，LncRNA的異常表達(dá)和紊亂與包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病有關(guān)，LncRNA能夠通過(guò)多種機(jī)制參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命進(jìn)程的調(diào)控，從而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。MEG3在許多正常細(xì)胞中均有表達(dá)，而在多種腫瘤中則表達(dá)水平較低，并且其表達(dá)下調(diào)與骨肉瘤[5，8]的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。已有研究證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MEG3能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移[9-10]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[9-11]，同時(shí)能夠降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性[12-13]。

MG-63和U-2 OS為體外研究骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的重要細(xì)胞模型。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)正常成骨細(xì)胞hFOB1.19和MG-63、U-2 OS中MEG3的表達(dá)水平，確定MEG3在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)降低。為了增加實(shí)驗(yàn)可信度，我們選擇兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象。將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-MEG3轉(zhuǎn)染MG-63和U-2 OS，利用qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3的骨肉瘤細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平升高。然后通過(guò)CCK-8、Transwell和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MEG3的MG-63和U-2 OS均表現(xiàn)出增殖和侵襲能力受抑，細(xì)胞凋亡率增加，但是其作用的分子機(jī)制尚不夠清楚。多個(gè)研究結(jié)果顯示MEG3能夠調(diào)控miR-29[10]、miR-181s[9]、miR-141[11]的表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究[12,14-15]揭示過(guò)表達(dá)MEG3能夠誘導(dǎo)P53和Caspase 9的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl2和Bcl-x的表達(dá)，提示MEG3可能通過(guò)P53途徑和線粒體途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。還有研究[1,16]發(fā)現(xiàn)，MEG3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)缺失是由于其啟動(dòng)子區(qū)或基因間差異甲基化區(qū)(DMR)甲基化修飾所致。有證據(jù)[17-18]顯示miR-148a能夠通過(guò)甲基化修飾調(diào)控MEG3的表達(dá)，從而影響腫瘤進(jìn)展。

總之，本研究從細(xì)胞水平證實(shí)LncRNA MEG3具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，同時(shí)促進(jìn)凋亡的作用，但是MEG3發(fā)揮作用的分子機(jī)制還有待于深入研究。

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