沉默精氨酸琥珀酸合成酶對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響

李 越，何玉婷，李晶晶，陳 潔，余 炎，胡秋月，闞全程，余祖江

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。目前，HCC在全球癌癥死亡中居于第3位[1]，每年大約有69萬(wàn)人死于HCC[2]。因?yàn)樵缙诎Y狀不明顯，超過(guò)80%的HCC患者在中晚期才被診斷，且缺乏十分有效的治療手段。雖然手術(shù)切除是目前最有效的方法，但即使經(jīng)過(guò)手術(shù)治療，HCC的復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[3]。精氨酸琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1, ASS1)可以催化瓜氨酸和天冬氨酸合成精氨酸代琥珀酸，在精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase, Asl)的作用下，生成精氨酸。ASS1是人體內(nèi)合成精氨酸的關(guān)鍵限速酶，主要在肝臟和腎臟中表達(dá)，其表達(dá)水平因細(xì)胞的種類、分化程度和作用而異[4]。早期研究[5]表明，在不同癌細(xì)胞系中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)調(diào)節(jié)ASS1。崔慧鵬[6]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患中，ASS1高表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯小于ASS1低表達(dá)患者；而邱福銘[7]研究發(fā)現(xiàn)，ASS1低表達(dá)患者比ASS1高表達(dá)患者的總生存率低，并且ASS1可作為乳腺癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。但是，目前關(guān)于ASS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用卻報(bào)道不多。因此，本研究通過(guò)沉默ASS1基因，探討ASS1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、主要材料及儀器肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721、QGY-7703、HepG2、HepG3B) 和人正常肝臟細(xì)胞(Changliver)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)和DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司)；慢病毒shRNA-ASS1購(gòu)自漢恒生物科技有限公司；Annexin V-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量RCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；ASS1和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)SMMC-7721、QGY-7703、HepG2和HepG3B細(xì)胞。在含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)Changliver細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3不同肝癌細(xì)胞系中ASS1mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)用Trizol提取SMMC-7721、QGY-7703、HepG2、HepG3B和Changliver的總RNA，按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。ASS1上游引物：5’-TTATA ACCTGGGATGGGCACC-3’，下游引物：5’-TGGACAT AGCGTCTGGGATTG-3’；β-actin上游引物：5’- CTC CATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物：5’-GCTGT CACCTTCACCGTTCC-3’。PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變形5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4不同肝癌細(xì)胞系中ASS1蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)離心收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃ 10 000g離心，吸取上層清液。BCA比色法測(cè)定蛋白總濃度。120 g/L的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液室溫?fù)u床封閉1 h。一抗(按11 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入熒光二抗(按110 000稀釋)室溫孵育1 h，應(yīng)用Licor公司的Odysseyclx雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜。應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量以其與GAPDH灰度值的比值表示。

1.5shRNA-ASS1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響將SMMC-7721細(xì)胞以每個(gè)孔1×105個(gè)接種于6孔板中，并將其分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和shRNA-ASS1組。24 h后換液，向shRNA-ASS1組加入含有20 μg shRNA慢病毒濃縮液的完全培養(yǎng)基，并向其中加入Polybrene使其濃度為5 mg/L。感染24 h后，去除含慢病毒的培養(yǎng)基，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基；向陰性對(duì)照組中加入20 μg慢病毒空載體。每組均設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)72 h后，向96孔板中加入10 μL CCK-8溶液，再37 ℃孵育1 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白對(duì)照、陰性對(duì)照組及shRNA-ASS1組細(xì)胞，1×105/孔鋪于6孔板上，24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。用400 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，1×105/管，加5 μL Annexin V-APC和5 μL PI 避光靜置15 min，用美國(guó)BD公司FACScantoⅡ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較不同肝癌細(xì)胞系中ASS1 mRNA和蛋白表達(dá)的差異以及shRNA-ASS1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同肝癌細(xì)胞系中ASS1mRNA和蛋白的表達(dá)見(jiàn)表1。

2.2shRNA-ASS1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響見(jiàn)表2。

表1 不同肝癌細(xì)胞系中ASS1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

*：與Changliver相比，P<0.05

表2 shRNA-ASS1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響

*：與空白對(duì)照組相比，P<0.05

3 討論

近年來(lái)，靶向治療已成為研究和治療許多惡性腫瘤的研究新熱點(diǎn)。目前認(rèn)為索拉菲尼是對(duì)肝癌較為有效的靶向藥物，索拉菲尼通過(guò)抑制RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。然而，對(duì)于原發(fā)性肝癌仍缺少有效的靶向藥物。有研究[9]表明，ASS1可能與晚期癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)，標(biāo)志著一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)，但是ASS1在HCC中的作用并不清楚。因此，本研究采用慢病毒介導(dǎo)的沉默技術(shù)探究ASS1在HCC的所發(fā)揮的作用。

ASS1最初是在研究哺乳動(dòng)物肝臟中尿素合成時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，其首次是于1951作為催化精氨酸合成瓜氨酸的酶而純化的。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，ASS1在大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)都存在，是生成尿素的關(guān)鍵酶[10]。ASS1基因位于第9號(hào)染色體，其是由同源四聚體所構(gòu)成。通過(guò)比較不同動(dòng)物中cDNA序列，ASS1在人、狗、小鼠中高度同源[11]。人ASS1的生化結(jié)構(gòu)主要由三部分組成：多聚螺旋C端、核苷酸結(jié)合處以及合成酶部分。通過(guò)研究瓜氨酸血證的病人發(fā)現(xiàn)，ASS1存在多種突變位點(diǎn)。當(dāng)大部分位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，這些位點(diǎn)會(huì)與周圍的配體形成二聚體或多聚體從而導(dǎo)致構(gòu)象結(jié)構(gòu)發(fā)生改變以及電子的再分布。除此以外，其中一部分突變位點(diǎn)能夠與底物特異性結(jié)合并直接發(fā)揮催化作用，比如Gln41(Leu)和Arg127(Cys)。

為了解ASS1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖和凋亡的影響，本研究首先檢測(cè)并篩選HepG2、HepG3B、SMMC-7721、MHCC-97H及正常肝細(xì)胞Changliver中ASS1表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在HepG3B、SMMC-7721中ASS1表達(dá)較高。因此，本研究選擇SMMC-7721用于shRNA介導(dǎo)的ASS1基因沉默的研究。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染后篩選證實(shí)，經(jīng)Western Blot驗(yàn)證，shRNA-ASS1組相較于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組蛋白表達(dá)水平下調(diào)，提示慢病毒介導(dǎo)的shRNA在蛋白水平有效抑制ASS1在SMMC-7721的表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)中，shRNA-ASS1-c組細(xì)胞較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組生長(zhǎng)曲線明顯下移，證實(shí)ASS1可促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)，沉默ASS1基因后SMMC-7721-shRNA生長(zhǎng)受到抑制。而細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提示，沉默ASS1基因可顯著促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞早期凋亡，這表明ASS1可抑制SMMC-7721細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮促癌基因的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒技術(shù)成功沉默ASS1基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡率升高。這表明ASS1基因與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡有著密切關(guān)系，ASS1基因可能成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。這也為后續(xù)明確ASS1基因在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中所發(fā)揮的作用及其具體機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] NGUYEN CB,KOTTURI H,WARIS G, et al.(Z)-3,5,4’-Trimethoxystilbene limits hepatitis C and cancer pathophysiology by blocking microtubule dynamics and cell-cycle progression[J].Cancer Res,2016,76(16):4887

[2] WU Q,QIN SK,TENG FM, et al.Lobaplatin arrests cell cycle progression in human hepatocellular carcinoma cells[J].J Hematol Oncol,2010,3(1):43

[3] LEE CY,SIT WH,FAN ST, et al.The cell cycle effects of docosahexaenoic acid on human metastatic hepatocellular carcinoma proliferation[J].Int J Oncol,2010,36(4):991

[4] SHAN YS,HSU HP,LAI MD, et al.Increased expression of argininosuccinate synthetase protein predicts poor prognosis in human gastric cancer[J].Oncol Rep,2015,33(1):49

[5] SHAN YS,HSU HP,LAI MD, et al.Argininosuccinate synthetase 1 suppression and arginine restriction inhibit cell migration in gastric cancer cell lines[J]. Sci Rep,2015,5:9783

[6] 崔慧鵬. 精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)高表達(dá)與結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展的相關(guān)性研究[D]. 北京:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院;解放軍醫(yī)學(xué)院，2015.

[7] 邱福銘. 精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)作為新型乳腺癌分子分型標(biāo)記物及乳腺癌個(gè)體化治療新靶點(diǎn)的研究[D].杭州：浙江大學(xué), 2013.

[8] ZAHAVI T,LANTON T,DIVON MS,et al.Sorafenib treatment during partial hepatectomy reduces tumorgenesis in an inflammation-associated liver cancer model[J].Oncotarget,2016,7(4):4860

[9] MCALPINE JA,LU HT,WU KC,et al.Down-regulation of argininosuccinate synthetase is associated with cisplatin resistance in hepatocellular carcinoma cell lines: implications for PEGylated arginine deiminase combination therapy[J].BMC Cancer,2014,14:621

[10]HUSSON A,BRASSE-LAGNEL C,FAIRAND A,et al.Argininosuccinate synthetase from the urea cycle to the citrulline-NO cycle[J].Eur J Biochem,2003,270(9):1887

[11]黃祝.精氨酸琥珀酸合酶的研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2014,45(1):41