成纖維生長(zhǎng)因子-2聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的分化

孫 微，王海萍，呂 洋，李 柔，陳曉依

河北北方學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 河北張家口 075000

在人們生活質(zhì)量有所提升的同時(shí)，心血管病的易患率及病死率也陸續(xù)攀升，心肌梗死近期以及陳舊期的相關(guān)疾病對(duì)人類健康產(chǎn)生的危害十分嚴(yán)重。在各類有害因素的作用下可導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生不可逆性損傷，目前臨床上通過(guò)介入治療、藥物等方法均未能改善梗死區(qū)的心肌損傷，有研究[1]報(bào)道干細(xì)胞移植將有望成為從根本上治療這一疾病的優(yōu)選方式。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)可發(fā)揮自身復(fù)制、免疫耐受、分化發(fā)育為多種細(xì)胞等生物學(xué)功效，近年研究[2]發(fā)現(xiàn)，在不同的誘導(dǎo)劑作用下BMMSCs可向神經(jīng)元樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多方向分化。在胚胎發(fā)育早期階段心臟形成的過(guò)程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)參與其中并發(fā)揮關(guān)鍵作用，另外BMP-2也參與了干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程[3]。在細(xì)胞的募集、增殖、分化過(guò)程中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(basic fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)發(fā)揮調(diào)控作用，且研究[4]發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)分化中FGF-2的調(diào)控作用更加顯著，其可直接將細(xì)胞核的有絲分裂能力和效率提高?；诖耍緦?shí)驗(yàn)以FGF-2和BMP-2單一及聯(lián)合作為誘導(dǎo)劑對(duì)大鼠BMMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，獲得心肌樣細(xì)胞分化表型，并從細(xì)胞、基因?qū)用嫣剿髌鋯我患奥?lián)合誘導(dǎo)的有效性，為 BMMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞并植入治療心臟疾病提供思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑3周齡清潔健康SD大鼠(北大維信生物科技公司；動(dòng)物合格證號(hào)為：2540100036428)，體重25～35 g，雌雄不拘。大鼠抗體CD45-FITC/CD29-PE/CD90-PE-CyTM7(Germany-MERCK公司)；免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(NOVUS公司)；IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)；BMP-2、FGF-2抗體(R&D公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Invitrogen公司)；α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)、結(jié)蛋白(desmin)(北京博奧森公司)；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、有絲分裂原活化蛋白激酶(p38mapk)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)(武漢易泰科技有限公司)；Prime-ScriptTMRT Master Mix(日本MBL公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2大鼠BMMSCs的分離培養(yǎng)采用頸椎脫臼法處死9只SD大鼠，于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液中浸潤(rùn)其四肢，4～6 min后在無(wú)菌條件下去除上下肢長(zhǎng)骨骨干周圍肌肉等組織，分離好的長(zhǎng)骨在加有雙抗(青霉素、鏈霉素混合液)的PBS中漂洗2～3下。剪除骨骺端，顯露骨髓腔，用無(wú)菌濾膜過(guò)濾由IMDM完全培養(yǎng)基從骨髓腔中沖出的骨髓，將其接種于培養(yǎng)瓶里，并吸取10 μL體積分?jǐn)?shù)為0.04%的臺(tái)盼藍(lán)與1滴上述細(xì)胞懸液混勻，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×1014L-1，隨后移至以飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃為基礎(chǔ)條件的細(xì)胞恒溫箱中，為其創(chuàng)造生長(zhǎng)環(huán)境。24 h后換液去除懸浮細(xì)胞，此后每72 h換1次液，貼壁細(xì)胞融合度達(dá)85%～95%時(shí)用胰蛋白酶消化，以2/3或1/2的比例接種到無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。

1.3BMMSCs形態(tài)學(xué)觀察每d在相差顯微鏡下對(duì)誘導(dǎo)及接種換代前后細(xì)胞的大小、排列方式、狀態(tài)等改變進(jìn)行對(duì)比，并拍照標(biāo)記。

1.4BMMSCs表面標(biāo)志物的鑒定將第4代細(xì)胞培養(yǎng)液棄除，PBS潤(rùn)洗1次，加入2 mL胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，并于鏡下察看細(xì)胞回縮后用培養(yǎng)基迅速阻止消化。將多次重復(fù)吹打所得懸液裝至無(wú)菌離心管中，室溫條件下離心棄上清，隨后PBS浸洗，并重復(fù)2～3次。細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)并均勻移至無(wú)菌離心管中，密度均為1×107mL-1，每管為250 μL。前4管依次加入CD90-PE-CyTM7抗體25 μL、CD45-FITC抗體10 μL、CD29-PE抗體25 μL和CD90-PE-CyTM7抗體25 μL+CD45-FITC抗體10 μL+CD29-PE抗體25 μL，最后1管加入PBS做對(duì)照，4 ℃避光孵育，30 min后室溫離心，PBS潤(rùn)洗1次；再次離心，棄上清，加入500 μL PBS，5支管均進(jìn)行細(xì)胞重懸。最后用流式細(xì)胞儀對(duì)以上3種抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.5BMMSCs體外誘導(dǎo)分化取第1代BMMSCs，消化后將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106mL-1，置于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中并標(biāo)記為第2代BMMSCs，培養(yǎng)48 h后加入誘導(dǎo)劑，根據(jù)誘導(dǎo)劑差別將其分為4組，F(xiàn)GF-2誘導(dǎo)組加1 μg/L的FGF-2，BMP-2誘導(dǎo)組加5 μmol/L的BMP-2，聯(lián)合誘導(dǎo)組加5 μmol/L的BMP-2和1 μg/L的FGF-2，對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑。加入誘導(dǎo)劑72 h后棄除各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基，改用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d，在相差顯微鏡下觀察并拍照標(biāo)記各組細(xì)胞的大小、排列方式、狀態(tài)等變化。培養(yǎng)中換液間隔為48～72h，貼壁細(xì)胞融合度達(dá)85%～95%時(shí)用胰蛋白酶消化，以2/3或1/2的比例接種到無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。

1.6誘導(dǎo)分化的BMMSCs免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)待各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)28 d后進(jìn)行爬片處理，PBS洗2次后用40 g/L多聚甲醛固定。將固定好的爬片用PBS浸洗后加過(guò)氧化氫-甲醇，室溫下避光孵育12 min，隨后PBS洗3次；微波修復(fù)22 min后用正常山羊血清封閉8 min。分別加入cTnT、desmin、α-actin和p38mapk單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。取出后室溫放置40 min，PBS浸洗后滴加羊抗兔IgG，放37 ℃溫育28 min；室溫下用PBS浸洗3次后滴加二氨基聯(lián)苯胺液顯色2 min。最后依次復(fù)染、脫水、封片固定。光學(xué)顯微鏡下尋找胞質(zhì)中有多數(shù)棕黃色顆粒聚集的細(xì)胞，并將此定為陽(yáng)性細(xì)胞，每組涂片均選取8個(gè)非重疊視野(×100)，分別計(jì)算4種指標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比(陽(yáng)性率=每個(gè)視野檢測(cè)指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.7BMMSCs誘導(dǎo)分化后相關(guān)基因mRNA的檢測(cè)選取上述各組培養(yǎng)28 d狀態(tài)良好且生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞進(jìn)行消化處理，提取各組細(xì)胞的總RNA，按RT-PCR的試劑盒說(shuō)明及引物的反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和目的基因GATA-4、Nkx2.5及α-MHC擴(kuò)增，用GAPDH作內(nèi)參對(duì)照?；蚣耙镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 基因及引物序列

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析；應(yīng)用2×2×3析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)FGF-2和BMP-2單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中相應(yīng)基因表達(dá)的影響進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)過(guò)程中BMMSCs的形態(tài)學(xué)特征取材初期獲得的骨髓懸液中90%為大小一致的圓形細(xì)胞，鏡下呈現(xiàn)為小亮點(diǎn)的形態(tài)，且培養(yǎng)液表面可見(jiàn)一層漂浮的血細(xì)胞；12 h后看到少量小亮點(diǎn)形態(tài)的細(xì)胞開(kāi)始貼向生長(zhǎng)面，細(xì)胞逐漸伸展、體積增大；24 h后進(jìn)行換液，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞貼壁數(shù)目增加，體積也隨之增大；72 h后貼壁細(xì)胞外周有形狀不同的突起長(zhǎng)出，細(xì)胞趨于矮梭形，同時(shí)也存在橢圓形及不規(guī)則形細(xì)胞，胞核居中，形同成纖維細(xì)胞。第7天時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)95%以上，外周突起進(jìn)一步伸展(圖1)。血細(xì)胞、造血干細(xì)胞等逐漸在換液、傳代過(guò)程中被篩除，整體觀察細(xì)胞大小、形狀逐漸長(zhǎng)成排列一致的細(xì)梭狀，細(xì)胞的生長(zhǎng)隨時(shí)間延續(xù)而加快，傳代間隔隨之而縮短。傳至第4代時(shí)，造血細(xì)胞的數(shù)量甚少，BMMSCs排列規(guī)則，形態(tài)均一，長(zhǎng)勢(shì)良好。

左：即刻分離的BMMSCs；右：培養(yǎng)4 d后的BMMSCs圖1 倒置相差顯微鏡下BMMSCs形態(tài)學(xué)變化(×100)

2.2大鼠BMMSCs鑒定運(yùn)用流式技術(shù)鑒定傳至第4代細(xì)胞的3種標(biāo)志物，結(jié)果表明：CD45、CD90、CD29的陽(yáng)性表達(dá)率依次為0.3%、84.7%、86.5%。

2.3大鼠BMMSCs在誘導(dǎo)分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖2。

左：空白對(duì)照組培養(yǎng)至第4周的BMMSCs；右：聯(lián)合誘導(dǎo)組培養(yǎng)至第4周的BMMSCs圖2 大鼠BMMSCs形態(tài)學(xué)變化(×100)

誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞外圍長(zhǎng)出不同形態(tài)的突起；培養(yǎng)72 h后聯(lián)合誘導(dǎo)與FGF-2誘導(dǎo)組、BMP-2誘導(dǎo)組相比貼壁細(xì)胞數(shù)量多，且以矮梭形較為多見(jiàn)，也存在菱形及多邊形細(xì)胞，胞體間距逐漸縮短；培養(yǎng)10 d后細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞增多且排列趨于規(guī)則；培養(yǎng)14 d后聯(lián)合誘導(dǎo)中逐漸出現(xiàn)由細(xì)胞匯聚成的集落，F(xiàn)GF-2誘導(dǎo)組、BMP-2誘導(dǎo)組細(xì)胞未出現(xiàn)集落樣生長(zhǎng)多呈梭形或星芒形；培養(yǎng)28 d后聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞間連結(jié)更加緊密，集落增大，朝同向生長(zhǎng)，整體觀形似漩渦，F(xiàn)GF-2、BMP-2誘導(dǎo)組此現(xiàn)象不明顯。在培養(yǎng)期間空白對(duì)照組BMMSCs形態(tài)未見(jiàn)明顯改變，外觀上始終與成纖維細(xì)胞類似。

2.4免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定見(jiàn)表2和圖3。結(jié)果顯示：培養(yǎng)至第28天時(shí)各誘導(dǎo)組的BMMSCs胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)較多的棕黃色顆粒，橢圓形胞核位于中央，均陽(yáng)性表達(dá)各檢測(cè)指標(biāo)，而空白對(duì)照組中各檢測(cè)指標(biāo)則表現(xiàn)為弱陽(yáng)性或陰性，在聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞的4種標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)率均最強(qiáng)。

2.5誘導(dǎo)分化后各組細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表3、4。4組細(xì)胞中均可表達(dá)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子(Nkx2.5、GATA-4)，但未表達(dá)α-MHC。

表2 各組細(xì)胞中4種標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)率比較 %

1：聯(lián)合誘導(dǎo)組；2：對(duì)照組；A：α-actin蛋白；B：desmin蛋白；C：BMMSCs cTnT蛋白；D：p38mapk蛋白圖3 誘導(dǎo)28 d后BMMSCs的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果(SP,×400)

組別n第7天第14天第28天FGF?2誘導(dǎo)組30．80±0．030．40±0．082．80±0．17BMP?2誘導(dǎo)組31．20±0．090．30±0．022．10±0．19聯(lián)合誘導(dǎo)組30．25±0．020．60±0．033．60±0．25空白對(duì)照組31．00±0．011．00±0．011．00±0．01

FFGF-2=257.977，F(xiàn)BMP-2=83.103，F(xiàn)時(shí)間=459.987，F(xiàn)FGF-2×BMP-2=81.696，F(xiàn)FGF-2×?xí)r間=361.997，F(xiàn)BMP-2×?xí)r間=308.731，F(xiàn)FGF-2×BMP-2×?xí)r間=164.510，P均<0.001

表4 誘導(dǎo)分化后各組細(xì)胞中GATA-4 mRNA的表達(dá)

FFGF-2=137.486，F(xiàn)BMP-2=51.118，F(xiàn)時(shí)間=431.434，F(xiàn)FGF-2×BMP-2=82.569，F(xiàn)FGF-2×?xí)r間=179.198，F(xiàn)BMP-2×?xí)r間=100.191，F(xiàn)FGF-2×BMP-2×?xí)r間=147.301，P均<0.001

3 討論

心肌梗死的致死率高達(dá)12.5%，已成為影響大眾生活質(zhì)量提升的主要因素之一[5]。鑒于心肌細(xì)胞屬于永久細(xì)胞，故以往把攻克心肌梗死的目光匯聚在未受累的心肌細(xì)胞上，從而保存心臟功能。但近年來(lái)研究[6]表明，心梗后部分細(xì)胞可以進(jìn)行分裂增殖，但心梗時(shí)會(huì)損傷大量心肌細(xì)胞，極低的更新比率難以補(bǔ)救壞死的心肌細(xì)胞，病變后瘢痕組織替代心肌，致心肌收縮力下降而誘發(fā)心力衰竭。BMMSCs具有免疫耐受、便于分離提取、體外培養(yǎng)存活率高以及多向化分裂發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)，且已有研究者[7]發(fā)現(xiàn)BMMSCs可在誘導(dǎo)劑的作用下分化為心肌樣細(xì)胞，并可應(yīng)用細(xì)胞移植技術(shù)治療心肌梗死。細(xì)胞移植效果與植入前細(xì)胞的狀態(tài)密不可分，在該領(lǐng)域中誘導(dǎo)后干細(xì)胞的分化效果直接影響植入前細(xì)胞的狀態(tài)，因此找出一種合適的誘導(dǎo)方法是該領(lǐng)域有待解決的難題。

BMPs最早被發(fā)現(xiàn)在骨細(xì)胞的形成中具有重要作用，故名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白。近年來(lái)，有學(xué)者[3]發(fā)現(xiàn)BMPs在胚胎早期心臟形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，早期心臟的心內(nèi)膜墊、心肌組織以及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的細(xì)胞中均有BMPs表達(dá)。BMP-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的重要成員，作為一種存在于組織中的細(xì)胞因子，在胚胎發(fā)育早期階段調(diào)節(jié)器官的生成，研究[8]發(fā)現(xiàn)BMP-2基因缺失可引起心臟發(fā)育不全甚至導(dǎo)致胚胎死亡。此外，BMP-2也可促進(jìn)心臟表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4，從而被用于促使BMMSCs向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族有23個(gè)成員，F(xiàn)GF-2是該家族中一員，廣泛分布于腎上腺、胸腺、黃體、垂體、腦、下丘腦、視網(wǎng)膜、心、肝、腎、胎盤(pán)等組織中[9]。FGF-2參與血管生成的調(diào)控，其在生理情況下可刺激細(xì)胞分裂增殖，而在病理情況下有助于被破壞組織器官的重構(gòu)，同時(shí)也在微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，可加強(qiáng)缺血組織側(cè)支循環(huán)的建立和開(kāi)放[9]。在細(xì)胞由G0 、G1期進(jìn)入S期的過(guò)程中，F(xiàn)GF-2能夠發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)神經(jīng)外胚層和中胚層細(xì)胞快速增殖分化[10]，鑒于心肌由中胚層分化而來(lái)，因此FGF-2可作為促使BMMSCs發(fā)育為心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)物質(zhì)。

目前已有實(shí)驗(yàn)[3-4]證實(shí)FGF-2和BMP-2均可作用于BMMSCs使其發(fā)育為心肌細(xì)胞，且能測(cè)出心肌細(xì)胞早期相關(guān)性能。為進(jìn)一步攻克分化效果不理想的難題，本實(shí)驗(yàn)用以上兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)合的方法為BMMSCs提供合適的誘導(dǎo)環(huán)境，探索其作用于BMMSCs后能否改善分化效果，從而選出促使BMMSCs向心肌細(xì)胞分化發(fā)育的最優(yōu)誘導(dǎo)條件。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁并差速傳代法分離純化BMMSCs[11]，誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞養(yǎng)至28 d時(shí)均存在矮柱狀相鄰緊密的似心肌細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，其中聯(lián)合誘導(dǎo)組該結(jié)構(gòu)最明顯，而空白對(duì)照組為成纖維細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，從形態(tài)學(xué)上初步說(shuō)明FGF-2與BMP-2單一及聯(lián)合均可誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，且兩者聯(lián)合誘導(dǎo)形態(tài)變化較明顯。

通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)FGF-2與BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)的有效性。Desmin蛋白在胞內(nèi)發(fā)揮骨架作用；在胞外可維持胞外基質(zhì)聯(lián)結(jié)，同時(shí)參與心肌細(xì)胞收縮再生、線粒體功能調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，目前已有研究證實(shí)，在心肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中desmin是不可或缺的功能蛋白[12]。在心肌纖維收縮過(guò)程中α-actin蛋白可特異結(jié)合心肌，在心肌收縮過(guò)程中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用[13]。心肌肌鈣蛋白參與心肌舒縮活動(dòng)的協(xié)調(diào)，其由c-TnT、c-TnI 、c-TnC 3個(gè)亞型構(gòu)成，其中c-TnT具有較高的心肌特異性[14]，因此在分析心肌細(xì)胞的分化效果時(shí)檢測(cè)特異性較高的c-TnT陽(yáng)性表達(dá)率。檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組于顯微鏡下均可見(jiàn)α-actin、desmin和c-TnT的陽(yáng)性細(xì)胞，但在空白對(duì)照組中只見(jiàn)陰性細(xì)胞或弱陽(yáng)性細(xì)胞；此外，誘導(dǎo)組中α-actin和desmin的陽(yáng)性率均較高，表明誘導(dǎo)組部分細(xì)胞產(chǎn)生了肌源性分化；結(jié)果還顯示聯(lián)合誘導(dǎo)組c-TnT陽(yáng)性率最高，說(shuō)明部分細(xì)胞已向心肌細(xì)胞進(jìn)行分化；綜合上述檢測(cè)結(jié)果，提示經(jīng)誘導(dǎo)后BMMSCs大部分獲得肌細(xì)胞表型，部分獲得心肌細(xì)胞表型，且是由肌細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程，另外經(jīng)BMP-2和FGF-2聯(lián)合誘導(dǎo)后各項(xiàng)指標(biāo)的陽(yáng)性率均高于單一誘導(dǎo)，說(shuō)明聯(lián)合誘導(dǎo)可改善分化效果。

BMMSCs需經(jīng)多種復(fù)雜信號(hào)通路傳遞轉(zhuǎn)導(dǎo)信息才可順利完成自我復(fù)制及分化。在BMP-2誘導(dǎo)BMMSCs的過(guò)程中，其與相應(yīng)受體結(jié)合后主要激活p38mapk途徑進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分化，同時(shí)FGF-2作用于BMMSCs使其發(fā)育為心肌細(xì)胞的過(guò)程中也可活化以上通路。絲分裂源蛋白激酶家族包括3個(gè)成員：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、有絲分裂原活化蛋白激酶和氨基末端激酶，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中p38mapk主要對(duì)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、分裂、凋亡以及同步胞間功能等進(jìn)行調(diào)控[15]。該通路被激活后，經(jīng)過(guò)一串級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，完成信號(hào)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)，使心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子——肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancerfactor 2C，MEF2C)的活性提高，同時(shí)增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(Apetala1，AP-1)的表達(dá)和其與DNA結(jié)合的活性，并正性調(diào)節(jié)Nkx2.5、GATA-4等心肌標(biāo)志性基因[16]。本實(shí)驗(yàn)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示誘導(dǎo)組均可見(jiàn)p38mapk的陽(yáng)性細(xì)胞，且聯(lián)合誘導(dǎo)組中陽(yáng)性細(xì)胞多于單一誘導(dǎo)組，而空白對(duì)照組為陰性。所以作者認(rèn)為p38mapk參與了BMMSCs向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程，且p38mapk的陽(yáng)性率高低間接表明BMMSCs的分化效果，由此得出BMMSCs經(jīng)BMP-2和FGF-2聯(lián)合誘導(dǎo)后的分化效果較單一誘導(dǎo)明顯。

MHC有兩種亞型(即α-MHC、β-MHC)，在心肌細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中β-MHC顯現(xiàn)于胚胎階段，而α-MHC顯現(xiàn)于成熟階段，兩者的含量比例可反映心肌細(xì)胞的分化程度；因此對(duì)其基因表達(dá)予以檢測(cè)，有助于分析心肌樣細(xì)胞的成熟程度。在心肌細(xì)胞生長(zhǎng)期間，GATA-4發(fā)揮不可或缺的標(biāo)志性作用。在脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育期間，Nkx2.5最早表達(dá)并發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其可顯著影響心臟發(fā)育[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-RCR分別檢測(cè)GATA-4、Nkx2.5及α-MHC在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況，從而分析BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的效果。結(jié)果表明，聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞Nkx2.5及GATA-4基因在第7天、14天、28天呈現(xiàn)“低-高-高”的表達(dá)趨勢(shì)，即在第7天時(shí)表達(dá)較弱，第14及28天時(shí)表達(dá)逐步上升；且就基因表達(dá)而言，與各單一誘導(dǎo)組相比，聯(lián)合誘導(dǎo)組效果明顯更優(yōu)；另外，空白對(duì)照組及誘導(dǎo)組α-MHC均為陰性，表明BMMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后常規(guī)培養(yǎng)28 d未達(dá)心肌樣細(xì)胞發(fā)育的成熟階段，而處于早期發(fā)展階段。進(jìn)一步證實(shí)了BMMSCs經(jīng)BMP-2和FGF-2聯(lián)合誘導(dǎo)后向心肌樣細(xì)胞分化的效果優(yōu)于單一誘導(dǎo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定、RT-RCR檢測(cè)等多種方法分析證實(shí)了BMMSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中可在FGF-2與BMP-2單一及聯(lián)合作為誘導(dǎo)劑的條件下分化為心肌樣細(xì)胞，且就誘導(dǎo)效果而言，聯(lián)合效果更佳。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為應(yīng)用組織細(xì)胞移植治療心肌梗死等危重心臟疾病的發(fā)展進(jìn)程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為改善植入細(xì)胞狀態(tài)從而保證移植效果開(kāi)辟新路徑。

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