一種新型雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建

馮 龍，馬云云，曹 珊，李曉娟，王媛媛，陳肖楠，孫倩倩，吳建博，趙國(guó)強(qiáng)

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科 鄭州 450046 2)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物與免疫學(xué)科 鄭州 451191 3)河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)科 鄭州 450046 4)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科 鄭州 450001

熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法，具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，而且對(duì)所測(cè)定的活體沒有任何毒性[1-2]。pGL4.10為Promega公司構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因載體，含有螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因(Firefly)，可用作定量分析哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的工具[3]。但由于pGL系列載體中只含有Firefly，因此使用中無法排除本底因素的干擾，容易產(chǎn)生檢測(cè)誤差。我們將海腎熒光素酶報(bào)告基因(hRLUC)克隆入pGL4.10載體中，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL4.10-hRLUC，該載體能夠同時(shí)表達(dá)Firefly 和hRLUC，并以hRLUC作為內(nèi)對(duì)照，這樣就為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提供了一條基準(zhǔn)線，減小了細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[4]，從而提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。現(xiàn)將構(gòu)建過程報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料HEK293細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。pGL4.10質(zhì)粒、pmirGLO質(zhì)粒、pGEM-T 載體、E1960熒光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于Promega 公司。TaqDNA聚合酶，Pfu高保真酶，限制性內(nèi)切酶SalⅠ、XhoⅠ和NheⅠ，T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自AxyGene 公司。G418和Lipofectamine3000購(gòu)自Invitrogen公司。引物合成及序列分析均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3hRLUC表達(dá)單元的擴(kuò)增以pmirGLO載體為模板，以R1、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得hRLUC表達(dá)單元。反應(yīng)體系：10×buffer 3 μL，4×dNTPs 2 μL，R1、R2 各0.5 μL，Pfu高保真酶0.5 μL，ddH2O18.5 μL，模板DNA 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸90 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃末延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L凝膠電泳，回收hRLUC表達(dá)單元并純化。

1.4pGL4.10-hRLUC的構(gòu)建用T4 DNA連接酶將hRLUC表達(dá)單元與pGEM-T載體連接，獲得重組載體pGEM-T-hRLUC，將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α，并進(jìn)行氨芐青霉素篩選。隨機(jī)篩選6個(gè)陽性菌落，分別以菌落裂解產(chǎn)物為模板，以T7/SP6為引物，進(jìn)行PCR。用限制性內(nèi)切酶SalⅠ分別對(duì)pGEM-T-hRLUC和pGL4.10進(jìn)行單酶切，并對(duì)雙粘pGL4.10進(jìn)行去磷酸化處理，再用T4 DNA連接酶將hRLUC表達(dá)單元與磷酸化的pGL4.10進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α。挑選陽性克隆，用SalⅠ酶切鑒定插入方向并進(jìn)行DNA測(cè)序，獲得雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL4.10-hRLUC。

1.5pGL4.10-hRLUC的表達(dá)鑒定首先將HEK293細(xì)胞接種于24孔pGEM-T載體板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)分組處理。pGL4.10-hRLUC組、pGL4.10組利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒， 6 h后更換含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用含G418 800 mg/L的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每2～3 d 換液1次。挑選陽性克隆，維持G418質(zhì)量濃度為200 mg/L擴(kuò)大培養(yǎng)。用PBS洗滌細(xì)胞3次，參照E1960熒光檢測(cè)試劑盒說明書，先加入裂解液裂解細(xì)胞，用Berthold Centro XS3 LB 960熒光檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)熒光值。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組相對(duì)熒光值的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1hRLUC表達(dá)單元擴(kuò)增結(jié)果以pmirGLO載體為模板，以R1、R2為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增結(jié)果見圖1，在2 350 bp處可見目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

M:Marker;1:hRLUC表達(dá)單元圖1 hRLUC表達(dá)單元的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2pGEM-T-hRLUC的鑒定結(jié)果pGEM-T-hRLUC經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌落篩選、PCR鑒定，證實(shí)含有hRLUC片段，見圖2。

2.3pGL4.10-hRLUC的酶切鑒定結(jié)果經(jīng)SalⅠ酶切鑒定，證實(shí)pGL4.10-hRLUC為正向插入克隆。經(jīng)DNA測(cè)序分析，證實(shí)pGL4.10-hRLUC質(zhì)粒序列與hRLUC表達(dá)單元序列完全一致。見圖2。

M:Marker;1～3:hRLUC表達(dá)單元;4:pGL4.10-hRLUC反向插入；5：pGL4.10-hRLUC正向插入圖2 pGEM-T-hRLUC的PCR 產(chǎn)物電泳圖(左)及SalⅠ酶切鑒定結(jié)果(右)

2.4 3組細(xì)胞相對(duì)熒光值的比較未轉(zhuǎn)染組、pGL4.10組、pGL4.10-hRLUC組細(xì)胞相對(duì)熒光值分別為(0.201±0.001)、(220.311±2.082)、(20.733±1.011)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.400，P<0.001)，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

pGL4.10載體為熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，含有Firefly，能夠用于定量分析基因表達(dá)[5]。但由于Promega公司的pGL系列載體中只含有Firefly，因此無法消除實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞活性或轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。已有研究[6]證實(shí)Firefly和hRLUC基因沒有種源同源性，兩者對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，反應(yīng)中沒有任何的交叉干擾。因此，如果將Firefly作為報(bào)告基因，以hRLUC作為對(duì)照基因，構(gòu)建雙報(bào)告系統(tǒng)，可以減少外部干擾，提高系統(tǒng)檢測(cè)的敏感性與可靠性。

據(jù)此，我們利用分子生物學(xué)技術(shù)將hRLUC基因插入到pGL4.10載體中，構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)Firefly和hRLUC的表達(dá)載體pGL4.10-hRLUC。將pGL4.10和pGL4.10-RLUC分別轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，采用Dual-Luciferase?雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定相對(duì)熒光值。結(jié)果顯示，pGL4.10-RLUC組細(xì)胞的相對(duì)熒光值較pGL4.10組明顯降低，證實(shí)表達(dá)載體中的hRLUC表達(dá)單元能夠正常工作，說明pGL4.10-hRLUC構(gòu)建成功并能夠正常表達(dá)。該載體可將hRLUC作為內(nèi)對(duì)照，為檢測(cè)提供一條基準(zhǔn)線，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。

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